The Effects of Passage Number on Spheroid Formation of Liver Cancer Cells

Year 2016, Volume: 8 Issue: 3, 24 - 28, 01.12.2016

Gizem Tatar Esra Şengül Hatice İsan Ranan Gülhan Aktaş

Abstract

Aim: The aim of the study was to investigate the relationship between the increase in the number of passages in the cells and the tendencies to create spherical structures, or “spheroids”, and therefore to investigate the relationship between the number of passages in liver cancer and possible cancer stem cell numbers. Materials And Methods: Second, seventh, eighth and ninth passage HepG2 cells; were grown in Dulbecco's Modified Eagle Media DMEM , Fetal Bovine Serum Dulbecco's FBS , and 1% streptomycin-penicillin at 37° C and 5% CO2 incubator. After confluency, live images at 1, 2, 3 and 4 weeks were recorded by using the Zeiss Inverted Phase Contrast Microscope. Some cells were fixed and stained with Hematoxylin-Eosin and Toluidine Blue. The morphological features of the spheroids were examined comparatively between different passages. Diameters and also the areas of the spheroids were measured by using the ImageJ analysis program. Results: The number of spheroids increases as the number of passages gets higher. The morphology of the cells at different part of the spheroids differ. However, there is no significant difference between the cells from the different passages at morphological level. The spheroid diameters are similar at different passages. The number of the cells inside the spheroids decrease accordingly with the culture time. Conclusions: The behavior of hepatocellular carcinoma cells in different passages after the long term culture and spheroid formation has been evaluated for the first time in this study. Increase in the formation of the spheroids might be due to increase at cancer stem cells

Keywords

HepG2, hepatocellular carcinoma, cancer stem cell, spheroid

Karaciğer Kanser Hücre Kültürlerinde Pasaj Sayısının Sferoid Oluşumuna Etkisi

Abstract

Amaç: Bu çalışmada; hücrelerdeki pasaj sayısı artışı ile küresel yapılar yani “sferoid” oluşturma eğilimleri arasındaki ilişkinin incelenmesi, dolayısıyla karaciğer kanserinde pasaj sayısı artışı ile olası kanser kök hücre sayıları arasındaki ilişkinin irdelenmesi hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntem: İkinci, yedinci, sekizinci ve dokuzuncu pasaj HepG2 hücreleri; Dulbecco's Modified Eagle Media DMEM , Fetal Bovine Serum Dulbecco's FBS ve %1 streptomisin-penisilin karışımı içeren besi yerlerinde, 37 C ısıdaki ve %5 CO2 içeren inkübatörlerde kültüre edildi. Tüm yüzeyi kapladıktan sonra 1., 2., 3. ve 4. haftalardaki canlı görüntüleri Zeiss İnverted Faz Kontrast Mikroskobu kullanılarak kaydedildi. Bu periyodların sonunda hücrelerin bir kısmı fikse edilerek Hematoksilen- Eozin ve Toluidin Mavisi ile boyandı. Farklı pasajlardan elde edilen görüntülerde sferoidlerin miktarı, sferoidler içerisindeki ve dışındaki hücrelerin morfolojik yapıları karşılaştırmalı olarak incelendi. Sferoidlerin çapları ve alanları ImageJ analiz programı kullanılarak ölçüldü. Bulgular: Morfolojik açıdan Pyrex borosilikat cam, D263M Schott cam ve polistiren yüzeylerde büyüyen hücreler arasında belirgin bir farklılık gözlemlenmedi. Ancak hücrelerin kapladığı alanlar ölçülerek karşılaştırıldığında; sırasıyla D263M Schott cam, polistiren ve pyrex borosillicate cam kültür yüzeyler üzerinde çoğalma oranının istatistiksel olarak anlamlı şekilde azalmış olduğu görüldü. Sonuçlar: Çalışmada; pasaj sayısı artışına bağlı olarak sferoid sayısında artış olduğu dikkati çekti. Sferoidlerin içerisindeki, sınırlarındaki ya da sferoid dışındaki hücrelerin morfolojileri birbirlerinden farklıydı; ancak pasajlar arasında bir farklılık yoktu. Sferoid çaplarının birbirlerine oldukça yakın olduğu görüldü. Sferoidlerin içerisindeki hücre sayısının kültür süresi arttıkça azaldığı ve hücre içermeyen alanların arttığı gözlendi. Sonuç: Çalışmamızda ilk kez farklı pasajlardaki hepatosellüler karsinoma hücrelerinin uzun süreli kültürlerdeki davranışı sferoid oluşturma özellikleri açısından karşılaştırmalı değerlendirilmiştir. Sferoid oluşumundaki artma; kanser kök hücreleri niteliğindeki hücre sayısında artış olabileceğini düşündürmektedir.

Keywords

HepG2, karaciğer kanseri, kanser kök hücresi, sferoid

References

• Sukach A, Ivanov E. Formation of spherical colonies as a property of stem cells. Cell and Tissue Biology, 2007;1:476– 481.
• Weiswald LB, Bellet D, Dangles-Marie V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia 2015: 17; 1–15.
• Pastrana E, Silva-Vargas V, Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell 2011; 8: 486–498.
• Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods, 1998:85;141–152.
• Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature, 2004: 432; 396–401.
• Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for prima- ry ductal carcinoma in situ: role of notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. Journal of the National Cancer Institute 2007: 99; 616–627
• Kakarala, M., et al. Targeting breast stem cells with the can- cer preventive compounds curcumin and piperine. Breast Cancer Research and Treatment 2010:122;777–785.
• Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2008;105: 13427–13432.
• Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of hu- man colon-cancer-initiating cells. Nature 2007: 445; 111– 115.
• Lu Cao, Yanming Zhou, Beibei Zhai, et al. Sphere-forming cell subpopulations with cancer stem cell properties in human hepatoma cell lines. BMC Gastroenterology 2011, 11:71.
• Karikusa F, Sawasaki Y.The Restoration Of The Functions Of Serially Passaged Calf Hepatocytes By Spheroid Forma- tion. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 1996,2:30-37.