Production of High Purity Beta Amanitin

Abstract

Objective: Beta amanitin has been used in experiment and has been purified only around 90%purity using existing methods. In this study, it has been aimed to describe the method in orderto produce high-purity beta amanitin using preparative HPLC.Methods: Amanita phalloides mushrooms hve been collected, extracted and purified 2 timesusing preparative HPLC. Validation of the toxin has been performed by comparison of retentiontime at HPLC and ultraviolet spectrum.Results: Beta amanitin was obtained with 91% (±2.36) purity after first purification process.Beta amanitin was obtained with 99,2% (±0.38) purity after second purification process. Itseemed that purified toxin and standard were given maximum absorbance at 303 nm andminumum absorbans at 263 nm, and the structure of the spectrums for both was similar.Conclusion: Beta amanitin with >%99 purity can be produced by this method

Keywords

• Beta amanitin,Preparative HPLC,Purification

Yüksek Saflıkta Beta Amanitin Üretimi

Abstract

Amaç: Beta amanitin nadiren bilimsel araştırmalarda kullanılmakta ve kullanımı gün geçtikçeartmaktadır. Piyasada bu ürün %90 saflıkta ticari olarak satılmaktadır. Bu araştırmada yükseksaflıkta beta amanitin üretme yöntemi tanımlanmıştır.Yöntem: Saflaştırma işlemi Amanita phalloides mantarlarından ekstraksiyonla yapılmıştır.Öncelikle bu mantarlar toplanmış, ekstrakte edilmiş, 2 defa preparatif HPLC ile saflaştırmaişlemi uygulanmıştır. Toksinin karşılaştırması, analitik HPLC sisteminde tutulma zamanı veultraviyole spektrumu karşılaştırılması yöntemleriyle yapılmıştır.Bulgular: İlk saflaştırma sonucunda elde edilen beta amanitin saflık oranı %91(±2,36) olarakölçülmüştür. İkinci saflaştırma sonucunda elde edilen beta amanitin saflık oranı %99,2(±0,38)olarak ölçülmüştür. Saflaştırma sonucu elde ettiğimiz toksin ile beta amanitin standardın UVspektrumlarında her ikisinde de 303 nm’de maksimum, 263 nm’de minimum absorbans verdiğive spektrum yapısının aynı olduğu görülmüştür.Sonuç: Tanımladığımız bu yöntemle, >%99 saflıkta beta amanitinin üretilmesi mümkündür

Keywords

• Beta amanitin,Preparatif HPLC,Saflaştırma

References

1. Bresinsky A, Besl H. A Colour Atlas of Poisonous Fungi. Wolf Publishing, London, 1990; 24-29.
2. Mat A: Türkiye’de mantar zehirlenmeleri ve zehirli mantarlar. Nobel Yayınları, İstanbul, 2000; 15-63.
3. Işıloğlu M, Gücin F, Mat A. Kasım 1994’te İstanbul’da meydana gelen mantar zehirlenmeleri. Ekoloji-Çevre Dergisi 4 (14), 22-28,1995.
4. Vetter J: Toxins of Amanita Phalloides. Toxicon 1998 Jan;36(1):13-24.
5. May JP, Fournier P, Patrick BO, Perrin DM. Synthesis, characterisation, and in vitro evaluation of Pro2-Ile3-S- deoxo-amaninamide Pro2-D-allo-Ile3-S-deoxo-amaninamide: implications for structure-activity relationships in amanitin conformation and toxicity. Chemistry. 2008;14(11):3410-7. and
6. Gong XQ, Nedialkov YA, Burton ZF. Alpha-amanitin blocks translocation by human RNA polymerase II. J Biol Chem 2004 Jun 25;279(26):27422-7.
7. Faulstich H, Talas A, Wellhöner HH. Toxicokinetics of labeled amatoxins in the dog. Arch Toxicol 1985 Jan;56(3):190-4.
8. Buku A, Campadelli-Fiume G, Fiume L, Wieland T. Inhibitory effect of naturally occurring and chemically modified amatoxins on RNA polymerase of rat liver nuclei. FEBS Lett 1971 Apr 12;14(1):42-44.

9. Zhao J, Cao M, Zhang J, Sun Q, Chen Q, Yang ZR. Pathological effects of the mushroom toxin alpha-amanitin on BALB/c mice. Peptides 2006 Dec;27(12):3047-52.
10. Foá-Tomasi L, Costanzo F, Campadelli-Fiume G. Enhanced inhibition of RNA synthesis by amanitins in in vitro cultured cells. Experientia. 1976 Jan 15;32(1):45-6.
11. Robinson-Fuentes VA, Jaime-Sánchez JL, García-Aguilar L, Gómez-Peralta M, Vázquez-Garcidueñas MS, Vázquez- Marrufo G. Determination of alpha- and beta-amanitin in clinical urine samples by Capillary Zone Electrophoresis. J Pharm Biomed Anal. 2008 Aug 5;47(4-5):913-7.
12. Yocum RR. New laboratory scale purification of beta- amanitin from American Amanita phalloides. Biochemistry. 1978 Sep 5;17(18):3786-9.
13. Kaya E, Karahan S, Yaykaşlı KO, Bayram R, Sarıtaş A. Purification of High Purity Alpha Amanitin Using Preparative HPLC Method. Konuralp Med J. 2012;4(3): 35-41
14. Wieland T, Wieland O: Chemistry and toxicology of the toxins of Amanita phalloides: Pharmacol Rev 1959 Mar;11(1):87-107.
15. Brüggemann O, Meder M, Freitag R. Analysis of amatoxins alpha-amanitin and beta-amanitin in toadstool extracts and body fluids by capillary zone electrophoresis with photodiode array detection. J Chromatogr A 1996 Sep 13;744(1-2):167- 76.