Development an in House Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Prototip and Microagglutination Test (MAT) Antigen for Serological Diagnosis of Tularemia

Abstract

In this study, a microagglutination test antigen stained by crystal violet and an in house Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA) prototip were developed in order to detect antibodies against Francisella tularensis. Besides, Western blot technnique was used as the confirmatory test. According to the results, diagnostic sensitivity of MAT, ELISA and WB was 100%, while diagnostic specificities of these tests were 100%, 98% and 96%, respectively. Seropositiviy rates of serum samples taken from 72 human were 4.2% for both tests. Seropositivity rates of 190 serum samples from sheep were 3.2% for MAT and 4.7% for ELISA. Results seem that tularemia exists in both humans and in animals. However, in order to make more definitive evaluation about the disease, more serum samples taken from various animal species are needed to be tested for this disease. As conclusion, it was thought that ELISA and confirmatory Western blot will be suitable combination for serologic diagnosis of tularemia.

Keywords

• F. tularensis
• MAT
• ELISA
• Western blot.

Tulareminin Serolojik Tanısı İçin In House Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Prototipi ve Mikroaglütinasyon Test (MAT) Antijeninin Geliştirilmesi

Abstract

Bu çalışmada, F. tularensis’e karşı gelişen antikorları saptamak için bir Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA) prototipi ve kristal viyole boyalı bir MAT antijeni geliştirildi. Ayrıca konfirme edici Western blot (WB) tekniği de serumlara uygulandı. Alınan sonuçlara göre MAT, ELISA ve WB testlerinin tanısal duyarlılıkları %100 olarak bulunurken, özgüllükleri sırası ile %100, %98 ve %96 olarak bulundu. Geliştirilen MAT ve ELISA ile 72 insan serumunda seropozitiflik oranı her iki teste de %4.2 olarak bulunurken, 190 koyun serumunda MAT ve ELISA seropozitifliği sırası ile %3.2 ve %4.7 olarak bulundu. Alınan sonuçlara göre ülkemizde tularemi insan ve hayvanlarda varlığını sürdüren bir infeksiyondur. Ancak daha sağlıklı epidemiyolojik yorum yapabilmek için daha çok sayıda seruma ve farklı hayvan türleri ile çalışılmasına ihtiyaç bulunmaktadır. Sonuç olarak, ELISA ve konfirme edici Western blotting kombinasyonunun tulareminin serolojik tanısında kullanılabilecek uygun bir kombinasyon olduğu düşünülmektedir.

Keywords

• F. tularensis, MAT, ELISA, Western blot.

References

1. 1. Çelebi G. Tularemi Sempozyumu, 2004. Erişim Tarihi: 19.03.2018: http://www.klimik.org.tr/ bilgimerkezi/tularemi/tularemi-yrd-doc-dr-guven-celebi-zonguldak-karaelmas-universitesi-tip-fakultesi-infeksiyon-hastaliklari-ve-klinik-mikrobiyoloji-anabilim-dali/
2. 2. Şahin İ. Tulareminin Bulaş Yolları In: Francisella tularensis ve Tularemi, eds. Gürcan Ş. Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul, 2009; 75.
3. 3. Tularemi Hastalığının Kontrolü İçin Saha Rehberi. Erişim Tarihi:11.5.2013. http://sbu.saglik.gov.tr/Ekutuphane/kitaplar/Tularemi%20Saha%20Rehberi.pdf.
4. 4. Çelebi B. Tularemi: Laboratuvar tanı, In: III. Zoonotik Hastalıklar Sempozyum Kitabı, Türkiye, 2010; 13-18.
5. 5. Francis E, Evans AC. Agglutination, cross-aggluti-nation, and agglutinin absorption in tularaemia. Public Health Rep. 1926; 41(26): 1273-1295.
6. 6. Kılıç S, Çelebi B, Yeşilyurt M. Evaluation of a commercial immuno-chromatographic assay for the serologic diagnosis of Tularemia. Diagn Microbiol Infect Dis. 2012; 74(1): 1-5.
7. 7. Ransmeier JC, Ewing CL. The agglutination reaction in Tularemia. J Infect Dis. 1941; 69: 193-205.
8. 8. Viljanen MK, Nurmi T, Salminen A. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with bacterial sonicate antigen for IgM, IgA, and IgG antibodies to Francisella tularensis: comparison with bacterial agglutination test and ELISA with lipopolysaccharide antigen. J Infect Dis. 1983; 148(4): 715-720.

9. 9. World Health Organization. WHO guidelines on tularemia. 2007. Geneva, Switzerland. Erişim Tarihi: 19.03.2018. http://www.cdc.gov/tularemia/resources/whotularemiamanual.pdf
10. 10. Brown SL, Mckinney FT, Klein GC, et al. Evaluation of a safranin-O-stained antigen microagglutination test for Francisella tularensis antibodies. J Clin Microbiol. 1980; 11(2): 146-148.
11. 11. Gaultney JB, Wende RD, Williams RP. Microagglutination procedures for febrile agglutination tests. Appl Microbiol. 1971; 22(4): 635-640.
12. 12. Massey ED, Mangiafıco JA. Microagglutination test for detecting and measuring serum agglutinins of Francisella tularensis. Appl Microbiol. 1974; 27(1): 25-27.
13. 13. Porsch Özcürümez M, Kischel N, Prıebe H, et al. Comparison of Enzyme-linked immunosorbent assay, Western blotting, microagglutination, indirect immunofluorescence assay, and flow cytometry for serological diagnosis of tularemia. Clin Diagn Lab Immunol. 2004; 11(6): 1008-1015.
14. 14. Sato T, Fujita H, Ohara Y, et al. Microagglutination test for early and specific serodiagnosis of tularemia. J Clin Microbiol. 1990; 28(10): 2372-2374.
15. 15. Yi EC, Hackett M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram negative bacteria. Analyst. 2000; 125(4): 651-6.
16. 16. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227:680-685.
17. 17. Towbin ST, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA. 1979; 76: 4350-4354.
18. 18. Çelebi B, Kılıç S. Tularemi mikroaglütinasyon testi için tetrazolyum mavisi ile boyalı Francisella tularensis antijeninin geliştirilmesi. Mikrobiyol Bul. 2013; 47(3): 514-522.
19. 19. Çelebi G, Baruönü F, Ayoğlu F, et al. Tularemia, a reemerging disease in northwest Turkey: epidemiological investigation and evaluation of treatment response. Jpn J Infect Dis. 2006; 59: 229-234.
20. 20. Carlsson HE, Lindberg AA, Lindberg G, et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for immunological diagnosis of human tularemia. J Clin Microbiol. 1979; 10(5): 615-621.
21. 21. Bevanger L, Maeland JA, Naess AI. Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of Tularemia. J Clin Microbiol. 1988; 26(3): 433-437.
22. 22. Eliasson H, Olcén P, Sjöstedt A, et al. Kinetics of the immune response associated with Tularemia: comparison of an enzyme-linked immunosorbent assay, a tube agglutination test, and a novel whole-blood lymphocyte stimulation test. Clin Vac Immun. 2008; 15(8): 1238-1243.
23. 23. Splettstoesser W, Guglielmo-Viret V, Seibold E, et al. Evaluation of an immunochromatographic test for rapid and reliable serodiagnosis of human Tularemia and detection of Francisella tularensis-specific antibodies in sera from different mammalian species. J Clin Microbiol, 2010; 48(5): 1629-1634.
24. 24. Schmitt P, Splettstosser W, Porsch Özcürümez ME, et al. A novel screening ELISA and a confirmatory Western blot useful for diagnosis and epidemiological studies of Tularemia. Epidemiol Infect. 2005; 133: 759-766.
25. 25. Chaignat V, Djordjevic-Spasic M, Ruettger A, et al. Performance of seven serological assays for diagnosing Tularemia. BMC Infectious Diseases. 2014; 14: 234-239.
26. 26. Bevanger L, Maeland JA, Naess AI. Competitive enzyme ımmunoassay for antibodies to a 43,000-molecular-weight Francisella tularensis outer membrane protein for the diagnosis of Tularemia. J Clin Microbiol. 1989; 27(5): 922-926.
27. 27. Otlu S. Hayvanlarda Tularemi araştırmaları ve dünyadaki durum. In: Francisella tularensis ve Tularemi, eds. Gürcan Ş, Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul, 2009; 161-168.
28. 28. Şeyda T. Kars bölgesinde koyunlarda Tularemi infeksiyonunun insidensi üzerinde serolojik ve kültürel çalışmalar. Kafkas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Doktora Tezi, 1996.
29. 29. Büyük F, Şahin M, Çelebi Ö, et al. Kars ve Ankara yöresine ait köpeklerde Francisella tularensis antikorlarının araştırılması. Turk Hij Den Biyol Derg. 2012; 69(2): 83–88.
30. 30. Bayram Y, Özkaçmaz A, Parlak M, et al. Van ili ve çevresinde risk altındaki insan ve hayvan gruplarında Tularemi seroprevalansı. Mikrobiyol Bul. 2015; 49(4): 532-541.
31. 31. Karataş Yeni D. Francısella tularensıs’in Muhtemel rezervuar hayvanlar ve koyunlarda laboratuvar tanısı. Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Doktora Tezi, 2013.