Sprague-dawley cinsi ratlarda telomer uzunluğunun kantitatif PCR ile ölçümü

Abstract

Telomer, kromozom uçlarında TTAGGG gibi, guaninden zengin kısa dizelerin ardışık tekrarlarından ve buna bağlı bazı proteinlerden oluşan bir kompleksdir. Farklı türdeki canlılarda ve aynı türde farklı hücre ve dokularda farklı uzunluklara sahiptir. DNA replikasyonu esnasında telomer 50-150 baz kadar kısalarak kromozomal stabilitenin korunmasına katkıda bulunur. Telomerin yaşlanma, kanser ve normal hücre biyolojisindeki önemini anlayabilmek için yapılan çalışmalarda; telomer uzunluğu, altın standart olarak kabul edilen Southern Blot yanında birkaç farklı metodla ölçülmüştür. Bu metodların kendine göre üstün ve eksik yönleri bulunmaktadır. Biz de bu çalışmada, ratların telomer uzunluğu ölçümünde kullanabileceğimiz ve daha sonraki çalışmalara da uygulanabilir bir kantitatif PCR protokolü oluşturmayı ve bu protokolle farklı rat dokularındaki telomer uzunlukları hakkında bilgi edinmeyi amaçladık. Dört erkek Sprague-Dawley cinsi ratın karaciğer, ince bağırsak ve pankreas dokusu ve lenfositlerinden DNA izolasyonu yapıldı. Numunelerde genom sayısını belirleyebilmek için tek kopya gen olarak 36B4 geni seçildi. 36B4 genine spesifik primerlerin kullanıldığı Q-PCR ile bir rat dokusundaki genom kopya sayısı bulundu. Rat genom standardı olarak kullanılan bu numune tüm numunelerdeki genom sayısını bulmak için kullanıldı. Tüm numunelerde telomer (T) ve 36B4 (S) için kantitatif PCR yapıldı. İki çalışmada ile elde edilen ürünler birbirine oranlarak her numune için T/S oranı daha sonra da bir kalibratör numune kullanılarak relatif T/S oranı hesaplandı. Ayrıca 10,2 kb telomer standardı kullanarak numunelerin telomer uzunlukları kilobaz olarak da hesaplandı. Relatif kantitasyon için mutlak gerekli olan Telomer ve 36B4 PCR çalışmalarında % 100 verimliliğe ulaştık. Bunu logaritmik başlangıç konsantrasyona karşı ΔCT grafiği slope değerinin 0,1’den küçük olması ile de gösterdik. Ayrıca telomer uzunluğu açısından rat dokuları arasında anlamlı bir fark bulundu (p < 0,05). Sonuç olarak rat dokularında telomer uzunluğu ölçümü için hassas, kolay ve hızlı bir Q-PCR protokolü oluşturduğumuzu düşünmekteyiz. 

Keywords

• Rat
• Sprague-Dawley
• Telomer
• 36B4
• Kantitatif PCR
• Relatif kantitasyon

References

1. Baerlocher, G.M., Mak, J., Tien, T., Lansdorp, PM., 2002. Telomere length measurement by fluorescence in situ hybridization and flow cytom- etry: Tips and pitfalls. Cytometry. 47, 88-99.
2. Cawthon, R.M., 2002. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47.
3. Cawthon, R.M., Smith, K.R., O'Brien, E., Sivatchenko, A., Kerber, R.A., 2003. Association between telomere length in blood and mortality in people aged 60 years or older. Lancet. 361, 393-395.
4. Cherif, H,, Tarry, J.L., Ozanne, S.E., Hales, C.N., 2003. Ageing and telomeres: A study into organ- and gender-specific telomere shortening. Nucleic Acids Res. 31, 1576-1583.
5. Cheung, I., Schertzer, M., Baross, A., Rose, A.M., Lansdorp, P.M., Baird, D.M., 2004. Strain-specific telomere length revealed by single telom- ere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391.
6. de Lange, T., Shiue, L., Myers, R.M., Cox, D.R., Naylor, S.L., Killery, A.M., Varmus, H.E., 1990. Structure and variability of human chromo- some ends. Mol. Cell. Biol. 10, 518-527.
7. Golubovskaya, V.M., Filatov, L.V., Behe, C.I., Presnell, S.C., Hooth, M.J., Smith, G.J., Kaufmann, W.K., 1999. Telomere shortening, telomerase expression and chromosome instability in rat hepatic epithelial stem-like cells. Mol. Carcinog. 24, 209-217.
8. Harley, C.B., Futcher, A.B., Greider, C.W., 1990. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460.

9. Hastings, R., Li, N., Lacy, P.S., Patel, H., Herbert, K.E., Stanley, A.G., Williams, B., 2004. Rapid telomere attrition in cardiac tissue of the ageing Wistar rat. Exp. Gerontol. 39, 855-857.
10. Jennings, B.J., Ozanne, S.E., Dorling, M.W., Hales, C.N., 1999. Early growth determines longevity in male rats and may be related to telomere shortening in the kidney. FEBS Lett. 448, 4-8.
11. Kipling, D., Cooke, H.J., 1990. Hypervariable ultra-long telomeres in mice. Nature. 347, 400-402.
12. Lansdorp, P.M., Verwoerd, N.P., van de Rijke, F.M., Dragowska, V., Little, M.T., Dirks, R.W., Rapp, A.K., Tanke, H.J., 1996. Heterogeneity in telomere length of human chromosome. Hum. Mol. Genet. 5, 685-691.
13. Lavoie, J., Bronsard, M., Lebel, M., Drouin, R., 2003. Mouse telomere analysis using an optimized primed in situ (PRINS) labeling technique. Chromosoma. 111, 438-444.
14. Makarov, V.L., Hirose, Y., Langmore, J.P., 1997. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest a C strand degradation mechanism for telomere shortening. Cell. 88, 657-666.
15. Moyzis, R.K., Buckingham, J.M., Cram, L.S., Dani, M., Deaven, L.L., Jones, M.D., Meyne, J., Ratliff, R.L., Wu, J.R., 1988. A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG) n, present at the telomeres of human chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6622-6626.
16. Nakamura, Y., Hirose, M., Matsuo, H., Tsuyama, N., Kamisango, K., Ide, T., 1999. Simple, rapid, quantitative, and sensitive detection of telom- ere repeats in cell lysate by a hybridization protection assay. Clin. Chem. 45, 1718-1724.
17. Prowse, K.R., Greider, C.W., 1995. Developmental and tissue-specific regulation of fare telomerase and telomere length. Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 4818-4822.
18. Rat Genome Sequencing Project Consortium, 2004. Genome sequence of the Brown Norway rat yields insights into mammalian evolution. Nature. Vol. 428.
19. Rubelj, I., Vondracek, Z., 1999. Stochastic mechanism of cellular aging – abrupt telomere shortening as a model for stochastic nature of cellular aging. J. Theor. Biol. 197, 425-438.
20. Saldanha, S.N., Andrews, L.G., Tollefsbol, T.O., 2003. Assessment of telomere length and factors that contribute to its stability. Eur. J. Biochem. 270, 389-403.
21. Son, N.H., Murray, S., Yanovski, J., Hodes, R.J., Weng, N., 2000. Lineage-specific telomere shortening and unaltered capacity fortelomerase expression in human T and B lymphocytes with age. J. Immunol. 165, 1191-1196.
22. Southern, E.M., 1975. Long range periodicities in fare satellite DNA. J. Mol. Biol. 94, 51-69.
23. Wai, L.K., 2004. Telomeres, telomerase, and tumorigenesis. Med.Gen.Med. 6, 19.
24. Yamaguchi, Y., Nozawa, K., Savoysky, E., Hayakawa, N., Nimura, Y., Yoshida, S., 1998. Change in telomerase activity of rat organs during growth and aging. Exp. Cell Res. 242, 120-127.
25. Zijlmans, J.M., Martens, U.M., Poon, S.S., Raap, A.K., Tanke, H.J., Ward, R.K., Lansdorp, P.M., 1997. Telomeres in the mouse have large inter- chromosomal variations in the number of TA2AG3 repeats. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 742.