Investigation of DNA and RNA viruses from paraffin-embedded tissue blocks using molecular methods

Öz

Polymerase chain reaction (PCR) is the most used molecular method in routine diagnosis for viral diseases. It is chosen for its high sensitivity and rapid results. One of the most important factors for reliability of results in PCR is the choice of sample material. Cold chain is mandatory for transporting the material and organ samples in particular may start decomposing if conditions are compromised and transport time is prolonged. Field staff may decide not to send organ samples in a case like this. Alternatively, formalin fixed paraffin embedded tissues do not need any specific conditions in transport which poses an advantage. The aim of this study is to create awareness in value of paraffin blocks in molecular diagnostics and investigate their practical importance in PCR applications. Two different frequently studied viruses were chosen, bovine papillomavirus (BPV) is chosen for representing DNA viruses and canine distemper virus (CDV) is chosen for representing RNA viruses. Five paraffin embedded tissue blocks for each virus, which are previously known to be positive, were used as material. Two different sets of primer pairs were chosen for PCR application, MY09/MY11 targeting L1 ORF region for BPV and a primer pair targeting nucleocapsid region for CDV. Reverse transcription was performed for samples of CDV before the PCR application. Four of the BPV samples and two of the CDV samples were deemed positive following PCR and RT-PCR. According to the results, paraffin embedded tissue blocks can be regarded valuable, albeit more efficiently for DNA viruses and less efficiently in RNA viruses. Additionally, our findings indicate there might be false negative results and this should be taken into consideration when planning the studies.

Anahtar Kelimeler

• Virus
• Polymerase Chain Reaction
• Paraffin Embedded Tissue Block

Parafine gömülü doku bloklarından DNA ve RNA viruslarının moleküler yöntemlerle tespit edilmesi

Öz

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) viral hastalıkların rutin teşhisi için kullanılan en önemli yöntemlerden biridir. Duyarlılığının hassas olması ve hızlı sonuç alınması nedeniyle tercih edilmektedir. PCR testinin sonuçlarını etkileyen en önemli faktörlerden biri de test için alınacak olan marazi maddenin doğru seçilmesidir. Marazi maddenin nakli için soğuk zincir şarttır ve uzun süren taşımalarda özellikle şartlar bozulursa organ örnekleri kokuşmaya başlayabilir. Saha personeli bu durum göz önüne alarak organ örnekleri yollamayabilir. Alternatif olarak parafine gömülen dokular, nakil şartları için özel koşullar gerektirmemektedir. Bu durum transport için önemli bir avantaj sağlar. Bu çalışmada, parafin blokların moleküler tanı için değerlendirilmesine dikkat çekmek ve bunların PCR uygulamasında pratik olarak tanıdaki önemi belirtilmeye çalışılmıştır. Örnek olarak sık çalışılan viruslardan DNA nükleik aside sahip bovine papillomavirus (BPV), RNA nükleik aside sahip olan canine distemper virus (CDV) seçilmiştir. Her iki hastalık için pozitif olduğu bilinen vakalardan 5 ‘er adet parafine gömülü doku kullanılmıştır. Bu amaçla BPV tanısı için L1 ORF bölgesine yönelik MY09/MY11 primer seti kullanılmış, CDV için ise nükleokapsit bölgesine yönelik bir primer seti seçilmiştir. RNA nükleik aside sahip olan CDV için PCR öncesi reverse transkripsiyon basamağı eklenmiştir. Yapılan PCR ve RT-PCR sonucunda BPV dokularının 4’ünde CDV dokularının ise 2’sinde pozitiflik tespit edilmiştir. Bu durum bize parafin bloktaki dokuların özellikle DNA viruslarında daha verimli, RNA viruslarında ise daha az verimli olarak kullanılabileceğine işaret etmektedir. Bununla beraber, sonuçlar değerlendirildiğinde yanlış negatifliklerin elde edilebileceği görülmekte ve planlanan çalışmalarda bu durum öngörülerek hareket edilmesi önem taşımaktadır.

Anahtar Kelimeler

• Virus
• Polymerase Chain Reaction
• Paraffin Embedded Tissue Block

Kaynakça

1. Belak, S., & Ballagi-Pordany, A. (1993). Application of the polymerase chain reaction (PCR) in veterinary diagnostic virology. Veterinary Research Communications, 17(1), 55-72.
2. Espy, M. J., Uhl, J. R., Sloan, L. M., Buckwalter, S. P., Jones, M. F., Vetter, E. A., ... & Smith, T. (2006). Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clinical microbiology reviews, 19(1), 165-256.
3. Frisk, A. L., Konig, M., Moritz, A., & Baumgartner, W. (1999). Detection of canine distemper virus nucleoprotein RNA by reverse transcription-PCR using serum, whole blood, and cerebrospinal fluid from dogs with distemper. Journal of clinical microbiology, 37(11), 3634-3643.
4. Gryseels, S., Watts, T. D., Kabongo Mpolesha, J. M., Larsen, B. B., Lemey, P., Muyembe-Tamfum, J. J., ... & Worobey, M. (2020). A near full-length HIV-1 genome from 1966 recovered from formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences, 117(22), 12222-12229.
5. Howe, J. R., Klimstra, D. S., & Cordon-Cardo, C. (1997). DNA extraction from paraffin-embedded tissues using a salting-out procedure: a reliable method for PCR amplification of archival material. Histology and histopathology, 12(3), 595-602.
6. Jones, N. L. (2002). PCR. In PCR Mutation Detection Protocols (pp. 37-46). Humana Press.
7. Karakurt, E., Coskun, N., Dag, S., Beytut, E., Ataseven, V. S., Yilmaz, V., Dogan, F., Nuhoglu, H., Ermutlu, CS., Aydin, U., Kuru, M., & Yildiz, A. (2022). Molecular detection of Papillomavirus and immunohistochemical investigation of p53 gene expressions in bovine papillomas and fibropapillomas. Archives of microbiology, 204(5), 278. https://doi.org/10.1007/s00203-022-02902-0
8. Ogawa, T., Tomita, Y., Okada, M., Shinozaki, K., Kubonoya, H., Kaiho, I., & Shirasawa, H. (2004). Broad-spectrum detection of papillomaviruses in bovine teat papillomas and healthy teat skin. Journal of general virology, 85(8), 2191-2197.

9. Pikor, L. A., Enfield, K. S., Cameron, H., & Lam, W. L. (2011). DNA extraction from paraffin embedded material for genetic and epigenetic analyses. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (49), e2763.
10. Sánchez-Romero, M. I., Moya, J. M. G. L., López, J. J. G., & Mira, N. O. (2019). Collection, transport and general processing of clinical specimens in Microbiology laboratory. Enfermedades infecciosas y microbiologia clinica (English ed.), 37(2), 127-134.
11. Yilmaz, V., Coskun, N., Kuru, M., Kaya, S., Buyuk, F., & Celebi, O. (2020). Virological investigation of bovine herpes virus 1 and bovine herpes virus 4 infections in cattle with endometritis in kars province of turkey. Adv. Anim. Vet. Sci, 8(5), 531-535.
12. Yilmaz, V., Coskun, N., Timurkan, M. O., Karakurt, E., Nuhoglu, H., Erkilic, E. E., ... & Sezer, M. (2022). The investigation of canine distemper virus in different diagnosis materials of dogs using molecular and pathological methods, northeastern Turkey. Indian Journal of Animal Research, 56(3), 316-322.