Farklı Özellikteki Tris Sulandırıcıları ile Sulandırılan Koç Spermasının Dondurularak Saklanabilirliği Üzerine Dondurma Hızının Etkisi

Öz

Bu çalışma, standart ve ultra özellikteki kimyasal maddeler kullanılarak hazırlanan tris sulandırıcıları ile sulandırılan koç spermasının gerekli işlemlerin ardından hızlı ve yavaş dondurma yöntemlerine göre dondurulmasının çözdürme sonrası spermatozoonların motilite oranları ve kinematik hız parametre değerleri üzerine etkilerini araştırmak amacıyla yapılmıştır. Çalışmada altı farklı koçtan suni vajen yöntemi ile alınan spermalar kullanıldı. Alınan spermalar bireysel olarak 2 eşit kısma ayrıldı ve hazırlanan iki tris sulandırıcısı ile sulandırıldı. Sulandırılan spermalar 0.25 ml plastik payetlere çekilip 4°C’ye soğutuldu. Soğutmanın ardından, tüm sulandırılmış spermalar 4 saat süreyle ekilibre edildikten sonra bilgisayar sistemli otomatik dondurma kabininde sıvı azot buharında kısa süreli (7 dakikalık program) ve uzun süreli (28 dakikalık program) yöntemlere göre donduruldu. Dondurma sonrası payetler gruplarına göre plastik gobletlere yerleştirilerek analizler yapılıncaya kadar -196°C’deki sıvı azot tanklarında muhafaza edildi. Çözdürülen sperma örneklerinde bilgisayar destekli sperm analiz (CASA) sistemi kullanılarak motilite oranları ve kinematik parametre değerleri belirlendi. Çözdürme sonrası yapılan analizlerde her iki sulandırıcı içinde uzun süreli dondurma yönteminin kısa süreli dondurma yöntemine göre total motilite, progresif motilite ve hızlı hareket eden spermatozoon oranlarında önemli derecede bir artış sağladığı belirlendi. Ek olarak çözdürme sonrası elde edilen sonuçlar bireysel olarak değerlendirildiğinde; total motilite, progresif motilite, hızlı hareket eden ve hareketsiz (statik) spermatozoon oranı yönünden koçlar arasında önemli bireysel farklılıkların olduğu gözlendi. Sonuç olarak; koçlarda bireysel özelliklerin spermanın dondurulma başarısını etkileyen önemli bir faktör olabileceğini ortaya koymakta olup diğer türlerde ifade edilen sperması “iyi donan” ya da “kötü donan” hayvan profili tanımlamasının koçlar içinde yapılabileceği ileri sürülmektedir. Ayrıca koçlarda spermanın dondurulması sırasında uzun süreli dondurma yönteminin kullanılması önerilmektedir.

Anahtar Kelimeler

• Koç
• Bireysellik
• Dondurma Hızı
• Tris

Effect of Freezing Speed on the Freezability of Ram Semen Diluted with Tris Extenders of Different Properties

Abstract

This study was carried out to investigate the effects of freezing ram semen diluted with tris extenders prepared using standard and ultra-specific chemicals, following the necessary procedures, using fast and slow freezing methods, on the motility rates and kinematic speed parameter values of spermatozoa after thawing. Semen taken from six different rams using the artificial vagina method was used in the study. The collected semen was individually divided into 2 equal parts and diluted with two prepared tris diluents. The diluted semen was collected into 0.25 ml plastic straws and cooled to 4°C. After cooling, all diluted semen were equilibrated for 4 hours and then frozen in liquid nitrogen vapor in a computerized automatic freezing cabinet according to short-term (7-minute program) and long-term (28-minute program) methods. After freezing, the straws were placed in plastic goblets according to their groups and stored in liquid nitrogen tanks at -196°C until analysis. Motility rates and kinematic parameter values were determined in the thawed semen samples using the computer-assisted sperm analysis (CASA) system. In the analyzes performed after thawing, it was determined that the long-term freezing method in both extenders provided a significant increase in total motility, progressive motility and fast-moving spermatozoon rates compared to the short-term freezing method. Additionally, when the results obtained after thawing are evaluated individually; It was observed that there were significant individual differences between rams in terms of total motility, progressive motility, fast moving and immobile (static) spermatozoon ratio. In conclusion; It reveals that individual characteristics in rams may be an important factor affecting the success of freezing semen, and it is suggested that the animal profile definition of "well-frozen" or "bad-frozen" semen, as expressed in other species, can be made in rams. It is also recommended to use the long-term freezing method when freezing semen in rams.

Keywords

• Ram
• Individuality
• Freezing Speed
• Tris

References

1. Bearden, H.J., Fuquay, J.W., Willard, S.T. (2004). *Applied animal reproduction*. 6th ed. New Jersey: Pearson Prentice Hall.
2. Byrne, G.P., Lonergan, P., Wade, M., Duffy, P., Donovan, A., Hanrahan, J.P., Boland, M.P. (2000). Effect of freezing rate of ram spermatozoa on subsequent fertility in vivo and in vitro. *Anim Reprod Sci.*, 62, 265–275. https://doi.org/10.1016/S0378-4320(00)00121-4
3. Díaz, R., Torres, M.A., Bravo, S., Sanchez, R., Sepúlveda, N. (2016). Determination of fatty acid profile in ram spermatozoa and seminal plasma. *Andrologia*, 48, 723-726. https://doi.org/10.1111/and.12506
4. Gil, J., Lundeheim, N., Söderquist, L., Rodriguez-Martinez, H. (2003). Influence of extender, temperature, and addition of glycerol on post-thaw sperm parameters in ram semen. *Theriogenology*, 59, 1241-1255. https://doi.org/10.1016/S0093-691X(02)01177-9
5. Güngör, İ.H., Dayan Cinkara, S., Acısu, T.C., Arkalı, G., Koca, R.H., Akarsu, S.A., Can, C., Özer Kaya, Ş., Kızıl, M., Çakır, A., Fırat, F., Halıcı, S.M., Yılmaz, İ., Badıllı, N., Yüce, A., Gür, S., Sönmez, M., Türk, G. (2022). Effect of hydrated carbon 60 fullerene on frozen ram semen quality. *Biopreserv. Biobank.*, 20(4), 340-347. https://doi.org/10.1089/bio.2021.0001
6. Hafez, B., Hafez, E. (2000). *Reproduction in farm animals*. 7th ed. Kiawah Island, South Carolina, USA: Copyright © Lippincott Williams & Wilkins. https://doi.org/10.1002/9781119265306
7. Hinkovska-Galcheva, V., Peeva, D., Momchilova-Pankova, A., Petkova, D., Koumanov, K. (1998). Phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine derivatives, membrane fluidity and changes in the lipolytic activity of ram spermatozoa plasma membranes during cryoconservation. *Int J Biochem.*, 20, 867-871. https://doi.org/10.1016/0020-711x(88)90076-6
8. İnanç, M.E., Güngör, Ş., Ata, A. (2017). Spermatozoa motilitesinin değerlendirilmesinde bilgisayar destekli sperm analiz sisteminin kullanımı. *Turkiye Klin J Reprod Artif Insemin Special Topics.*, 3, 73-78.

9. Kulíková, B., Baláži, A., Tóthová, J., Jurˇcík, R., Huba, J., Chrenek, P. (2018). Dilution factor affects the ability of ram sperm to survive cryopreservation: Short communication. *Slovak J. Anim. Sci.*, 51, 41–44.
10. Layek, S.S., Kumaresan, A., Gorani, S., Elango, K., Karuppanasamy, K., Kishore, G., Gupta, O. (2022). Recent developments in bovine semen cryopreservation. *Current Concepts in Bovine Reproduction*, 223–242. https://doi.org/10.1007/978-981-19-0116-4_12
11. Maxwell, W.M.C., Salamon, S. (1993). Liquid storage of ram semen: a review. *Reprod. Fertil. Dev.*, 5, 613-638. https://doi.org/10.1071/RD9930613
12. Mehta, V., Pareek, P.K., Kumar, A., Purohit, G.N. (2020). Comparative effect of different concentrations of glycerol and ethylene glycol and temperature on cryopreservation of ram semen. *Research Journal of Veterinary Practitioners*, 8(3), 37-41. https://10.17582/journal.rjvp/2020/8.3.37.41
13. Nur, Z., Zik, B., Ustuner, B., Tutuncu, S., Sagirkaya, H., Ozguden, C.G., Gunay, U., Dogan, I. (2011). Effect of freezing rate on acrosome and chromatin integrity in ram semen. *Ankara Üniv Vet Fak Derg*, 58, 267–272. https://doi.org/10.1501/Vetfak_0000002486
14. Ozer Kaya, Ş., Gungor, İ.H., Dayan Cinkara, S., Acisu, T.C., Koca, R.H., Akarsu, S.A., Can, C., Çakir, A., Yilmaz, İ., Halici, M.S., Gur, S., Sonmez, M., Turk, G. (2021). Effect of different doses of hydrated C60 fullerene nanoparticles on ram semen during cool-storage. *Turk J Vet Anim Sci*, 45(1), 139-147. https://10.3906/vet-2006-29
15. Parks, J.E., Graham, J.K. (1992). Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. *Theriogenology*, 38, 209-222. https://doi.org/10.1016/0093-691X(92)90231-F
16. Pontbriand, D., Howard, J., Schiewe, M.C., Syuart, L.D., Wildt, D.E. (1989). Effect of cryoprotective diluent and method of freeze-thawing on survival and acrosomal integrity of ram spermatozoa. *Cryobiology*, 26, 341-354. https://doi.org/10.1016/0011-2240(89)90058-8
17. Rickard, J.P., Schmidt, R.E., Maddison, J.W., Bathgate, R., Lynch, G.W., Druart, X., De Graaf, S.P. (2016). Variation in seminal plasma alters the ability of ram spermatozoa to survive cryopreservation. *Reprod. Fertil. Dev.*, 28, 516–523. https://doi.org/10.1016/0011-2240(89)90058-8
18. Saha, M.A., Asaduzzaman, M., Bari, F.Y. (2022). Cryopreservation techniques for ram sperm. *Vet Med Int.*, 1-16, e7378379. https://doi.org/10.1155/2022/7378379
19. Salamon, S., Maxwell, W.M. (2000). Storage of ram semen. *Anim Reprod Sci.*, 62, 77-111. https://doi.org/10.1016/S0378-4320(00)00155-X
20. Sönmez, M., Fırat, F. (2022). Bilgisayar destekli sperma analiz (CASA) sistemiyle yapılan incelemelerde spermatozoonların motilitesini ve kinematik değerlerini etkileyen faktörler. *Fırat Üniversitesi Sağlık Bilimleri Veteriner Dergisi*, 36 (2), 153-164.
21. Sönmez, M. (2022). *Veteriner hekimlikte reprodüksiyon, suni tohumlama ve androloji ders notları*. Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Dölerme ve Suni Tohumlama Anabilim Dalı, Elazığ.
22. Swelum, A.A., Ba-Awadh, H., Olarinre, I., Saadeldin, I.M., Alowaimer, A. (2022). Effects of adding mixed chicken and quail egg yolks to the cryodiluent on the quality of ram semen before and after cryopreservation. *Front Vet Sci.*, 1544, 1-13. https://doi.org/10.3389/fvets.2022.1013533
23. Ustuner, B., Alcay, S., Nur, Z., Sagirkaya, H., Soylu, M.K. (2014). Effect of egg yolk and soybean lecithin on tris-based extender in post-thaw ram semen quality and in vitro fertility. *Kafkas Univ. Vet. Fak. Derg.*, 20, 393-398. https://doi.org/10.9775/kvfd.2013.10248
24. Vichas, L., Tsakmakidis, I.A., Vafiadis, D., Tsousis, G., Malama, E., Boscos, C.M. (2018). The effect of antioxidant agents’ addition and freezing method on quality parameters of frozen thawed ram semen. Cell Tissue Bank. 19; 113–121. https://doi.org/10.1007/s10561-017-9633-6
25. Vozaf, J., Makarevich, A.V., Balazi, A., Vasicek, J., Svoradova, A., Olexikova, L., Chrenek, P. (2021). Cryopreservation of ram semen: Manual versus programmable freezing and different lengths of equilibration. Anim. Sci. J., 92, e1-9, 13670. https://doi.org/10.1111/asj.13670
26. Watson, P.F. (2000). The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal Reprod Sci., 60, 481–492. https://doi.org/10.1016/S0378-4320(00)00099-3
27. Yánez-Ortiz, I., Catalán, J., Rodríguez-Gil, J.E., Miró, J., Yeste, M. (2022). Advances in sperm cryopreservation in farm animals: Cattle, horse, pig and sheep. Anim. Reprod. Sci., 246, 106904. https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2021.106904
28. Zamiri, M.J. (2020). Update on semen cryopreservation in sheep and goats: A review. J. Livest. Sci. Technol., 8, 1–15. https://doi.org/10.22103/JLST.2020.15927.1321
29. Zhang, L., Wang, X., Jiang, C., Sohail, T., Sun, Y., Sun, X., Wang, J., L, Y. (2024). Effects of Different Diluents and Freezing Methods on Cryopreservation of Hu Ram Semen. Vet. Sci. 2024, 11, 251. https://doi.org/10.3390/vetsci11060251