Kültür Levrek (D. labrax) Balıklarından İzole Edilen Vibrio anguillarum İzolatlarının Karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada kültür levrek balıklarında (D. labrax) Vibriosise neden olan Vibrio anguillarum’un bakteriyolojik, moleküler ve serolojik karakterizasyonu yanısıra biyofilm oluşturma özelliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Araştırmada 150-200 gr ağırlığında, hastalık belirtileri gösteren 5 adet levrek balığından örnekleme yapılmıştır. Hasta balık örneklerinin iç organlarından farklı besiyerlerine bakteriyolojik ekimler yapılmıştır. Bakteri izolatları biyokimyasal özelliklerine göre V. anguillarum olarak adlandırılmıştır. İzolatlar, bu türe özgü olan rpoN PCR analizi sonucunda 519 bp’lik tek bant oluşturmuştur. V. anguillarum O1, O2 ve O3 serotiplerine karşı geliştirilmiş antikorlar kullanılarak gerçekleştirilen lam aglütinasyon ve Dot-blot testleri sonucunda; çalışmadaki hasta kültür levrek balığı örneklerinden izole edilen V. anguillarum izolatlarından elde edilen O-antijen ekstraktları yalnızca türün O1 serotipine karşı geliştirilen antikorla reaksiyona girmiştir. Referans bakteriler ile bu çalışmadan izole edilen 5 adet V. anguillarum izolatının ELISA plağında biyofilm oluşturma yetenekleri incelenmiştir. Sonuç olarak; bu çalışma ile V. anguillarum’un ülkemizde ilk kez Dot-blot metodu ile serotiplendirmesi yapılmıştır.

Keywords

• Dot-blot,Levrek,rpoN PCR,Vibrio anguillarum

Characterization of Vibrio anguillarum Isolates Recovered From Diseased Cultured European Sea Bass (D. Labrax)

Abstract

The aim of this study is the bacteriological, molecular and serological characterization and determination of the biofilm formation of Vibrio anguillarum isolates that induced vibriosis in cultured sea bass (D. labrax). In this study, sampling studies were made on 5 fish samples weighing between 150-200 g, showing some disease signs supplied from fish farm. As a result of the bacteriological inoculations on the different media made from the internal organs of the diseased fish samples such as liver, kidney and spleen. Bacterial isolates were identified as V. anguillarum according to their biochemical properties. Isolates that were identified as V. anguillarum formed a single band of 519 bp in the rpoN PCR analysis. In the slide agglutination and Dot-blot tests that were performed by using antibodies raised against V. anguillarum serotypes O1, O2 and O3, O-antigen extracts obtained from V. anguillarum recovered from diseased cultured sea bass in this study, only reacted with the antibody raised against serotype O1. As a result, with this study, serotyping of V. anguillarum by Dot-blot method was examined for the first time in Turkey with this study.

Keywords

• Dot-blot,sea bass,rpoN PCR,Vibrio anguillarum

References

1. Actis LA, Tolmasky ME, Crosa JH. Vibriosis, In: Fish Diseases and Disorders, Vol. 3, Woo, P.T.K. and Bruno, D.W. (eds). CAB Intern. Publ., UK. 1999, pp. 523-558.
2. Allison DG. 2003, The biofilm matrix. Biofouling. 1996; 19: 139-150.
3. Alpbaz A. Su Ürünleri Yetiştiriciliği, Alp Yayınevi, İzmir. 2005.
4. Austin B, Austin DA. Vibrionaceae Representatives, In: Bacterial Fish Pathogens, Eds; Austin B, Austin DA., 5th Ed., Springer Dordrecht Heidelberg, London, UK. 2012; pp.369-389.
5. Bolinches J, Lemos ML, Fouz B, Cambra M, Larsen JL, Toranzo AE. Serological relationships among Vibrio anguillarum strains. J Aquat Anim Health.1990; 2 (1): 21-29.
6. Buller N. Bacteria from Fish and Other Aquatic Animals: a Practical Identification Manual, Ed: NB Buller, CABI Publishing, Oxford, İngiltere. 2004, 261 pp.
7. Çağırgan H, Yüreklitürk O. Kültürü yapılan çipura (Sparus aurata) ve levrek (Dicentrarchus labrax) balıklarında görülen bakteriyel hastalıkların teşhis ve tedavisi üzerine bir araştırma. Bornova Vet. Kontrol ve Araş. Ens. Müd. Der. 1996; 21: 113-122.
8. Çelikkale MS, Düzgüneş E, Okumuş D. Türkiye Su Ürünleri Sektörü Potansiyeli, Mevcut Durumu, Sorunları ve Çözüm Önerileri, Eds; Çelikkale MS, Düzgüneş E, Okumuş D., İstanbul Ticaret Odası, İstanbul, Türkiye.1999.

9. Cipriano RC, Pyle JB, Starliper CE, Pyle SW. Detection of Vibrio anguillarum antigen by dot blot assay. J Wildl Dis. 1985; 21: 211- 218.
10. Defoirdt T, Bossier P. Sorgeloos P, Verstraete W. The impact of mutations in the quorum sensing systems of Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum and Vibrio harveyi on their virulence towards gnotobiotically cultured Artemia franciscana. Environ. Microbiol. 2005;7(8): 1239– 1247.
11. Demircan MD. Deniz balıklarında Vibriozis’e neden olan Vibrio anguillarum’un PCR yöntemi ile tanısı. Yüksek Lisans Tezi, 2004, T.C. İstanbul Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, İstanbul.
12. Demircan D, Candan A. Identification of Vibrio anguillarum by PCR (rpoN gene) associated with vibriosis in marine fish in Turkey. Turk J Vet Anim Sci. 2006; 30: 305-310.
13. Gonzalez SF, Osorio CR, Santos Y. Development of a PCRbased Method for The Detection of Listonella anguillarum in Fish Tissues and Blood Samples. Dis. Aquat. Org. 2003; 55: 109-115.
14. Güralp H. Deniz kültür balıklarında görülen bakteriyel patojenlerin teşhisi ve antibakteriyel maddelere duyarlılıklarının belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, T.C. İstanbul Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012.
15. Hirono I, Masuda T, Aoki T. Cloning and Detection of the Hemolysin Gene of Vibrio anguillarum. Microb Pathog. 1996; 21: 173-182.
16. Kimberley AW, Macnair NG. Finfish and Shellfish Bacteriology Manual: Techniques and Procedures. Eds: Kimberley AW, Macnair NG, Iowa State Press, Iowa, USA, 2004.
17. Knappskog DH, Rodseth OM, Slinde E, Endersen C. Immunochemical analyses of Vibrio anguillarum strains isolated from cod, Gadus morhua L., suffering from Vibriosis. J. Fish Dis.1993; 16: 327-338.
18. Korun J. Kültür Levrek Balıklarında (Dicentrarchus labrax, L.) Vibriosis ve Pasteurellosis’in Bazı Diagnostik Kitler ve Laboratuar Yöntemleri ile Teşhisi Üzerine Bir Çalışma. İstanbul Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi. 2004,143 pp.
19. Lindell K. Cell-to-Cell communication and virulence in Vibrio anguillarum. Department of Molecular Biology, Umea Center for Microbial Research UCMR, Umea, Sweden, 2012.
20. Memiş D. Deniz Balıkları Yetiştiriciliği, Filiz Kitabevi Basım Yayın Dağıtım, 2010, İstanbul, Türkiye.
21. Nagata EF, Eguchi M. Survival of Vibrio anguillarum, a Fish Pathogen, in Freshwater by Forming Biofilms. Microbes Environ. 2003; 18(4): 196-202.
22. Noga EJ. Fish Disease: Diagnosis and Treatment, Second Edition, Ed: Noga EJ, Iowa State University Press, Iowa, 2010.
23. Nurcan N, Kubilay A, Boşgelmez-Tınaz G. Vibrio anguillarum suşlarında çevreyi algılama sistemi ve virülens faktörlerinin incelenmesi. Eğirdir Su Ür. Fak. Der. 2016; 12(1):49-57.
24. O’toole G, Kaplan H, Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol. 2000; 54, 49-79.
25. Pearson PJ, Passadori L, Iglewski BH, Greenberg EP. A second Nacylhomoserine lactone signal produced by Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, 92: 1490-1494.
26. Pedersen K, Grisez L, Van Houdt R, Tiainen T, Ollevier F, Larsen JL. Extended Serotyping Scheme for Vibrio anguillarum with the Definition and Characterization of Seven Provisional O-Serogroups. Curr Microbiol. 1999; 38: 183-189.
27. Sorensen UBS, Larsen JL. Serotyping of Vibrio anguillarum. Appl. Environ. Microbiol.1986; 51(3): 593-597.
28. Timur G, Timur M. Balık Hastalıkları. Eds; Timur G, Timur M, İstanbul Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Yayını, İstanbul. 2003.
29. Toranzo AE, Baya AM, Roberson BS, Barja JL, Grimes DJ, Hetrıck FM. Specificity of slide agglutination test for detecting bacterial fish pathogens. Aquaculture.1987; 61, 81-97.
30. Santos Y, Pazos F, Toranzo AE. Biochemical and serological analysis of Vibrio anguillarum related organisms. Dis Aquat Org.1996; 26: 67-73.
31. Silva-Rubio A, Avendaño-Herrera R, Jaureguiberry B, Toranzo AE, Magariños B. First description of serotype O3 in Vibrio anguillarum strains isolated from salmonids in Chile. J Fish Dis. 2008; 31(3): 235–239.
32. Wang YS, Lauritz J, Jass J, Milton DL.Role for the major outer-membrane protein from Vibrio anguillarum in bile resistance and biofilm formation. Microbiology. 2003; 149: 1061–1071.
33. Woodward MJ, Marcjanna S, Siprigings AK, Humphrey TJ. The role of SEF14 and SEF17 fimbriae in the adherence of Salmonella enterica serotype enteritidis to inanimate surfaces. J Med Microbiol. 2000; 49: 481-487.
34. You JL, Xue XL, Cao LX, Lu X, Wang J, Zhang LX, Zhou SN. Inhibition of Vibrio biofilm formation by a marine actinomycete strain A66. Appl Microbiol Biotechnol. 2007; 76:1137–1144 .