Su örneklerinde norovirüs varlığının cross-flow mikrofiltrasyon ve RT-PCR ile belirlenmesi

Öz

Amaç: Ülkemizde halk sağlığını tehdit eden gastroenterit salgınların kontrol altına alınması ve salgın kaynağının tespit edilmesine yönelik su örneklerinden norovirüs varlığının cross-flow mikrofiltrasyon ve RTPCR Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile belirlenmesi için kullanılacak yöntemin uygulanabilirliğinin sağlanması amaçlanmıştır. Yöntem: Çeşitli hacimlerdeki su örnekleri içerisine belirlenmiş farklı miktarlardaki Mengo kontrol virüsü 4,21x10-5copy/µL ile klinik örneklerden izole edilmiş Norovirüs GII izolatları eklenmiştir. Bu su örnekleri, 10-30 kD’luk nominal moleküler ağırlıklı filtre kasetler kullanılarak cross-flow mikrofiltrasyon ile filtrasyon işlemi ve filtrasyon işlemi sonrası santrifüj işlemi uygulanmıştır. Santrifüj işlemi sonrası elde edilen üst sıvı kısımdan QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen, Crawley - UK üreticisinin talimatları doğrultusunda uygulanarak viral RNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. İzole edilen viral RNA’nın amplifikasyon işlemi ise RT-PCR kit Ceeram, Fransa kullanılarak RT-PCR ile yapılmıştır. Bulgular: Su örneklerine eklenen Mengo kontrol virüsü ve Norovirüs GII izolatları sırasıyla filtrasyon, santrifügasyon, viral RNA izolasyonu ve amplifikasyonu işlemi uygulanmıştır. Çalışmamızda, virüs miktarındaki geri kazanım oranının %20-25 arasında olduğu görülmüştür. Virüs miktarındaki geri kazanımın düşük olmasının sebebinin filtrasyon işleminin olduğu görülmüştür. Çalışmamızda; virüs kayıplarını minimize etmek için filtrasyon işlemi sonrası santrifüj işleminin uygulanmasının gerekliliği ortaya çıkarmıştır. 10 veya 30 kD’luk nominal moleküler ağırlıklı filtre kasetler kullanılarak filtrasyon işleminin yapılmasının virüs miktarındaki geri kazanıma etkisinin olmadığı ortaya çıkmıştır. Sonuç: Su örneklerinde norovirüs varlığının RT-PCR ile belirlenmesinde, filtrasyon aşamasının önemli bir yer tuttuğu görülmüştür. Virüs kaybının önlenebilmesi için büyük su hacimlere gereksinim duyulmaktadır.

Anahtar Kelimeler

• su, norovirüs, filtrasyon, RT-PCR

Determination of norovirus in water samples by cross-flow microfiltration and RT-PCR

Abstract

Objective: It is aimed to detect of the method to be applied for norovirus in water samples by RT-PCR Real Time Polymerase Chain Reaction and cross-flow microfiltration to determine the origin of epidemic and to control gastroenteritis epidemics that are a threat to public health in our country. Methods: Different amounts of Mengo control virus 4.21x10-5copy/µL and Norovirus GII isolates from clinical samples were added to various volumes of water samples. These water samples were first filtrated with cross-flow filtration using 10-30 kD nominal molecular weighed filter cassettes and then centrifuged. After centrifugation, viral RNA isolation was performed from the supernatant layer according to the instructions of QIAamp Viral Mini Kit Qiagen Crawley - UK producer. Amplification of isolated viral RNA was performed with RT-PCR by using RT-PCR kit Ceeram, France . Results: Filtration, centrifugation, viral RNA isolation and amplification were applied respectively to the water samples which Mengo control virus and Norovirus GII isolates were added. In our study, it was seen that recovery ratio of virus amount is among 20-25% range. It is seen that the main reason of poor recovery is the filtration process. This study showed us that it is necessary to apply centrifugation after filtration to minimize virus loss. Using 10 or 30 kD nominal weighed filter cassettes for filtration made no effect to virus recovery. Conclusion: It is seen that filtration is an important step in detection of norovirus in water samples with RT-PCR. Large volumes of water samples are needed to avoid virus loss.

Keywords

• water, norovirus, filtration, RT-PCR

References

1. 1. Anonymous. Gastroenteritler. T.C. Sağlık Bakanlığı, THSK, Bulaşıcı Hastalıkları Daire Başkanlığı. http://thsk.gov.tr/tr/index.php/su-ve-besinlerlebulasan-hastaliklar/369-gastroenterit_ishal, (Erişim Tarihi: 03.02.2014).
2. 2. Reynolds K, Mena K, Gerba C. Risk of waterborne illness via drinking water in the United States. Rev Environ Contam Toxicol, 2008; 192: 117-58.
3. 3. Siebenga JJ, Vennema H, Zheng DP, Vinjé J, Lee BE, Pang XL, et al. Norovirus illness is a global problem: emergence and spread of norovirus GII. 4 variants, 2001-2007. J Infect Dis, 2009; 200 (5): 802-12.
4. 4. Korukoğlu G, Çağlayık-Yağcı D. Viral gastroenteritlerin laboratuvar tanısı. www.klimik. org.tr/wp-content/uploads/2013/01/20.01.2013- GÜLAY-KORUKOĞLU-dıç.pdf, (Erişim Tarihi: 26.11.2013).
5. 5. Kireçci E, Özer A. Norovirüsler, salgınları ve mücadele. Van Tıp Derg, 2011;18 (1): 49-56.
6. 6. Yap J, Qadir A, Liu I, Loh J, Tan BH, Lee VJ. Outbreak of acute norovirus gastroenteritis in a military facility in Singapore: a public health perspective. Singapore Med J, 2012; 53 (4): 249-54.
7. 7. Xue C, Fu Y, Zhu W, Fei Y, Zhu L, Zhang H, et al. An outbreak of acute norovirus gastroenteritis in a boarding school in Shanghai: a retrospective cohort study. BMC Public Health, 2014; 14: 1092.
8. 8. Kauppinen A, Al-Hello H, Zacheus O, Kilponen J, Maunula L, Huusko S, et al. Increase in outbreaks of gastroenteritis linked to bathing water in Finland in summer 2014. Euro Surveill, 2017; 22 (8): 1-8.

9. 9. Pasco E. Virus concentration by crossflow membrane filtration: effect of hydrodynamic conditions and membrane properties. Doctoral Dissertation, Michigan State University, 2012.
10. 10. Laverick MA, Wyn-Jones AP, Carter MJ. Quantitative RT-PCR for the enumeration of noroviruses (Norwalk-like viruses) in water and sewage. Lett Appl Microbiol, 2004, 39: 127–36.
11. 11. Tong HI, Connell C, Boehm AB, Lu Y. Effective detection of human noroviruses in Hawaiian waters using enchanced RT-PCR methods. Water Res, 2011; 45 (18): 5837-48.
12. 12. Zhou X, Li H, Sun L, Mo Y, Chen S, Wu X, et al. Epidemiological and molecular analysis of a waterborne outbreak of norovirus GII.4. Epidemiol Infect, 2012; 140 (12): 2282-9.
13. 13. Gregory JB, Webster LF, Griffith JF, Stewart JR. Improved detection and quantitation of norovirus from water. J Virol Methods, 2011; 172 (1-2): 38- 45.
14. 14. Ramírez-Castillo FY, Loera-Muro A, Jacques M, Garneau P, Avelar-González FJ, Harel J, et al. Waterborne Pathogens: Detection Methods and Challenges. Pathogens, 2015; 4 (2): 307–34.
15. 15. Tian P, Yang D, Pan L, Mandrella R. Application of a receptor-binding capture quantitative reverse transcription-PCR assay to concentrate human norovirus from sewage and to study the distribution and stability of the virus. Appl Environ Microbiol, 2012; 78 (2): 429-36.
16. 16. Francy DS, Stelzer EA, Brady AMG, Huitger C, Bushon RN, Ip HS, et al. Comparison of filters for concentrating microbial indicators and pathogens in lake water samples. Appl Environ Microbiol, 2013; 79 (4): 1342–52.
17. 17. Lodder WJ, van den Berg HHJL, Rutjes SA, de Roda Husman AM. Presence of enteric viruses in source waters for drinking water production in the Netherlands. Appl Environ Microbiol, 2010;76 (17): 5965-71.