P1 transduction method to construct Escherichia coli mutant strains lacking more than one gene

Abstract

Assigning gene functions and performing phenotypic studies of the bacteria require the construction of specific mutants that at times should lack more than one gene due to the redundancy of particular gene activities. P1 phage is a generalized transducing phage that can be used in constructing double, triple or multiple mutants of Escherichia coli. This phage is able to mistakenly package random fragments of E. coli chromosome (~2 % of the genome into each particle) into the phage head during phage development.  The phages with E. coli DNA can inject that DNA into recipient cells. Given homology between donor and recipient, and a selectable marker, transductants can be obtained. For transduction, a virulent derivative of phage P1 is preferably used because this form cannot integrate into the bacterial genome. The virulent phage can only develop using the lytic mode of development and produces phage progeny upon lysis of the host cell. This technique is based on recombination technology, allowing the DNA fragments of the E. coli genome to be transported among the strains.

In this study, we optimized the P1 transduction methodology, which we aim to present to the Turkish scientific community in the native language with the experimental flow and sufficient details. For this reason, a number of four single gene mutants obtained from the KEIO collection were used. First, kanamycine (Kan) gene cassettes were removed from each mutant strain to create a recipient strain that is kan sensitive. The other four KEIO mutant strains with Kan^R cassettes were used as the donor strains and P1 phage were cultured with these strains and the lysates were obtained. These lysates and recipient strains were then transduced to integrate the DNA fragments of the lysates into the recipient strain genome. Upon selection with kanamycine, new mutant strains, double mutants are obtained. As a result, four double mutants namely DtsgAugpA, DyhdTompA, DugpAmdtG and DaroGmalF were obtained and the details pertaining to the protocols and results are presented and discussed.

Keywords

• P1 phage,transduction,Escherichia coli,double mutants

Project Number

114Z987

P1 transdüksiyon yöntemi ile birden fazla gen bakımından mutant olan Escherichia coli suşlarının elde edilmesi

Abstract

Bakterilerde gen fonksiyonlarının bulunması ve fenotipik çalışmalarının yapılabilmesi için mutantların oluşturulması gerekmektedir. Bazı durumlarda, birden fazla gen açısından mutant olan suşlar oluşturulmalıdır çünkü bazı spesifik aktiviteler birden fazla gen tarafından kodlanmaktadır. P1 fajı, Escherichia coli'de, ikili, üçlü veya çoklu mutantların oluşturulmasında başvurulan, genelleştirilmiş bir transdüksiyon fajıdır. Bu faj, gelişimi sırasında, E. coli kromozomunun parçalarını (her bir partikülde genomun yaklaşık % 2'si olmak üzere), rastgele bir şekilde faj kafasına paketleyebilmektedir. E. coli DNA’sını içeren fajlar, içerdikleri DNA parçalarını, alıcı bakteri hücrelerine enjekte edebilmektedir. Verici ve alıcı DNA bölgeleri arasındaki benzerlik ve seçici bir markır yardımıyla, transdüktanlar’ın elde edilmesi mümkün olmaktadır. Transdüksiyon için tercihen, P1 fajının, virülan bir türevi (P1vir) kullanılmaktadır, çünkü bu form, bakterinin genomuna entegre olamamaktadır. Fajın bu özelliğinin kullanılmasıyla geliştirilen tekniklerden birisi, P1 transdüksiyon tekniği olarak adlandırılmaktadır. Rekombinasyon teknolojisinde kullanılan bu teknik, E. coli genomuna ait DNA parçalarının, suşlar arasında taşınmasını sağlamaktadır.

Bu çalışmada, optimize ettiğimiz P1 transdüksiyon metodolojisinin, deneysel akış ve yeterli detaylarla birlikte, Türk bilim camiasına, ana dilimizde sunulması amaçlanmıştır. Bunun için, KEIO koleksiyonundan elde edilen dört adet tekli gen mutantları kullanılmıştır. İlk olarak, kanamisin (Kan) duyarlı bir alıcı suş oluşturmak için, her bir mutant suştan, Kan gen kasetleri çıkarılmıştır. Kan^R kasetlerine sahip diğer dört adet KEIO mutant suşu, donör suşlar olarak kullanılmış ve P1 fajı bu suşlar ile kültür edilerek, lizatlar elde edilmiştir. Bu lizatlar ve alıcı suşlar daha sonra, lizatlardaki fazjların içerdikleri DNA parçalarını, alıcı suş genomuna entegre edebilmesi için, transdüksiyona tabii tutulmuştur. Kanamisin ile seleksiyon sonucu, yeni mutant suşlar olan ikili mutantlar elde edilmiştir. Sonuçta, isimleri DtsgAugpA, DyhdTompA, DugpAmdtG ve DaroGmalF olan, dört adet ikili mutant oluşturulmuştur. Deneysel akıştaki ilgili protokoller ve sonuçlara ait detaylar sunulmuş ve tartışılmıştır.

Keywords

• P1 faj,transdüksiyon,Escherichia coli,ikili mutant

Supporting Institution

Tübitak

Project Number

114Z987

Thanks

Bu çalışma 114Z987 nolu Tübitak projesi tarafından desteklenmiştir. Ayrıca KEIO koleksiyonunu temin eden National BioResource Project Japan (NBRP) ve laboratuarımızdaki P1 deneysel alt yapısının kurulmasındaki değerli katkılarından dolayı sayın Prof. Dr. Tim Larson’a teşekkür ederiz. Muğla SK Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri koordinatörlüğüne de teşekkür ederiz.

References

1. Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA., Tomita, M., Wanner, BL., Mo,r H. 2006. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology 1744-4292/06.
2. Bertani G. 1951. Studies on lysogenesis. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. JBacteriol. Sep; 62 (3): 293-300.
3. Brammar, WJ. 2001. Specialized Transduction. Encyclopedia of Genetics. Pg 1858–1860.
4. Cherepanov, PP., Wackernagel, W. 1995. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene, 158, 9-14.
5. Datsenko, KA., Wanner, BL. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci. 6;97(12):6640-5
6. Lennox, ES. 1955. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology 1:190–206.
7. Lobock, BM., Rose, DJ., Plunkett, G., Rusin, M., Samojedny, A., Lehnherr, H., Yarmolinsky, MB., Blattner, FR. 2004. Genome of Bacteriophage P1. Journal of Bacteriology, 186/21,7032-7068.
8. Silhavy, TJ.., Berman, ML., Enquis,t LW. 1984. Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Trends in genetics. Trends in Genetics, Vol1, 61.

9. Snyder, L., Champness, W. 2007. Molecular genetics of bacteria. American Society for Microbiology,Washington,DC,USA.3rded.293-337.
10. Thomason, LC., Costantino, N., Court, DL. 2014. E. coli Genome Manipulation by P1 Transduction. Current protocols in molecular biology. 79/1, 1.17.1-1.17.8.
11. Yarmolinsky, MB., Sternberg, N. 1988. Bacteriophage P1. The Bacteriophages, vol 1.291–438.
12. Zhu, XD., Sadowski, PD. 1995. Cleavage-dependent Ligation by the FLP Recombinase. Characterization of a mutant flp protein with an alteration in a catalytic amino acid. Journal of Biological Chemistry, 270/ 39: 23044 –23054.
13. Zinder, ND. 1992. Forty years ago: the discovery of bacterial transduction. Genetics 132:291–294.
14. Zinder, ND., Lederberg, J. 1952. Genetic exchange in Salmonella. J. Bacteriol. 64:679–699.