P1 transduction method to construct Escherichia coli mutant strains lacking more than one gene

Yıl 2020, , 110 - 119, 13.03.2020

Esra Dibek , Merve Sezer Kürkçü , Begüm Hazar Çiftçi Bekir Çöl

https://doi.org/10.17798/bitlisfen.588763

Cited By: 1

Öz

Assigning gene
functions and performing phenotypic studies of the bacteria require the
construction of specific mutants that at times should lack more than one gene
due to the redundancy of particular gene activities. P1 phage is a generalized
transducing phage that can be used in constructing double, triple or multiple
mutants of Escherichia coli. This
phage is able to mistakenly package random fragments of E. coli chromosome (~2 % of the genome into each particle) into the
phage head during phage development.  The
phages with E. coli DNA can inject
that DNA into recipient cells. Given homology between donor and recipient, and
a selectable marker, transductants can be obtained. For transduction, a
virulent derivative of phage P1 is preferably used because this form cannot
integrate into the bacterial genome. The virulent phage can only develop using
the lytic mode of development and produces phage progeny upon lysis of the host
cell. This technique is based on recombination technology, allowing the DNA
fragments of the E. coli genome to be
transported among the strains.

In this study,
we optimized the P1 transduction methodology, which we aim to present to the
Turkish scientific community in the native language with the experimental flow
and sufficient details. For this reason, a number of four single gene mutants
obtained from the KEIO collection were used. First, kanamycine (Kan) gene
cassettes were removed from each mutant strain to create a recipient strain
that is kan sensitive. The other four KEIO mutant strains with Kan^R
cassettes were used as the donor strains and P1 phage were cultured with these
strains and the lysates were obtained. These lysates and recipient strains were
then transduced to integrate the DNA fragments of the lysates into the
recipient strain genome. Upon selection with kanamycine, new mutant strains,
double mutants are obtained. As a result, four double mutants namely DtsgAugpA, DyhdTompA, DugpAmdtG and DaroGmalF were obtained and the details pertaining to the
protocols and results are presented and discussed.

Anahtar Kelimeler

P1 phage, transduction, Escherichia coli, double mutants

Proje Numarası

114Z987

P1 transdüksiyon yöntemi ile birden fazla gen bakımından mutant olan Escherichia coli suşlarının elde edilmesi

Öz

Bakterilerde
gen fonksiyonlarının bulunması ve fenotipik çalışmalarının yapılabilmesi için
mutantların oluşturulması gerekmektedir. Bazı durumlarda, birden fazla gen
açısından mutant olan suşlar oluşturulmalıdır çünkü bazı spesifik aktiviteler
birden fazla gen tarafından kodlanmaktadır. P1 fajı, Escherichia coli'de, ikili, üçlü veya çoklu mutantların
oluşturulmasında başvurulan, genelleştirilmiş bir transdüksiyon fajıdır. Bu
faj, gelişimi sırasında, E. coli kromozomunun
parçalarını (her bir partikülde genomun yaklaşık % 2'si olmak üzere), rastgele
bir şekilde faj kafasına paketleyebilmektedir. E. coli DNA’sını içeren fajlar, içerdikleri DNA parçalarını, alıcı
bakteri hücrelerine enjekte edebilmektedir. Verici ve alıcı DNA bölgeleri
arasındaki benzerlik ve seçici bir markır yardımıyla, transdüktanlar’ın elde
edilmesi mümkün olmaktadır. Transdüksiyon için tercihen, P1 fajının, virülan
bir türevi (P1vir) kullanılmaktadır, çünkü bu form, bakterinin genomuna entegre
olamamaktadır. Fajın bu özelliğinin kullanılmasıyla geliştirilen tekniklerden
birisi, P1 transdüksiyon tekniği olarak adlandırılmaktadır. Rekombinasyon
teknolojisinde kullanılan bu teknik, E.
coli genomuna ait DNA parçalarının, suşlar arasında taşınmasını
sağlamaktadır.

Bu
çalışmada, optimize ettiğimiz P1 transdüksiyon metodolojisinin, deneysel akış
ve yeterli detaylarla birlikte, Türk bilim camiasına, ana dilimizde sunulması
amaçlanmıştır. Bunun için, KEIO koleksiyonundan elde edilen dört adet tekli gen
mutantları kullanılmıştır. İlk olarak, kanamisin (Kan) duyarlı bir alıcı suş
oluşturmak için, her bir mutant suştan, Kan gen kasetleri çıkarılmıştır. Kan^R
kasetlerine sahip diğer dört adet KEIO mutant suşu, donör suşlar olarak
kullanılmış ve P1 fajı bu suşlar ile kültür edilerek, lizatlar elde edilmiştir.
Bu lizatlar ve alıcı suşlar daha sonra, lizatlardaki fazjların içerdikleri DNA
parçalarını, alıcı suş genomuna entegre edebilmesi için, transdüksiyona tabii
tutulmuştur. Kanamisin ile seleksiyon sonucu, yeni mutant suşlar olan ikili
mutantlar elde edilmiştir. Sonuçta, isimleri DtsgAugpA, DyhdTompA, DugpAmdtG
ve DaroGmalF olan, dört adet
ikili mutant oluşturulmuştur. Deneysel akıştaki ilgili protokoller ve sonuçlara
ait detaylar sunulmuş ve tartışılmıştır.

Anahtar Kelimeler

P1 faj, transdüksiyon, Escherichia coli, ikili mutant

Destekleyen Kurum

Tübitak

Proje Numarası

114Z987

Teşekkür

Bu çalışma 114Z987 nolu Tübitak projesi tarafından desteklenmiştir. Ayrıca KEIO koleksiyonunu temin eden National BioResource Project Japan (NBRP) ve laboratuarımızdaki P1 deneysel alt yapısının kurulmasındaki değerli katkılarından dolayı sayın Prof. Dr. Tim Larson’a teşekkür ederiz. Muğla SK Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri koordinatörlüğüne de teşekkür ederiz.

Kaynakça

• Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA., Tomita, M., Wanner, BL., Mo,r H. 2006. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology 1744-4292/06.
• Bertani G. 1951. Studies on lysogenesis. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. JBacteriol. Sep; 62 (3): 293-300.
• Brammar, WJ. 2001. Specialized Transduction. Encyclopedia of Genetics. Pg 1858–1860.
• Cherepanov, PP., Wackernagel, W. 1995. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene, 158, 9-14.
• Datsenko, KA., Wanner, BL. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci. 6;97(12):6640-5
• Lennox, ES. 1955. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology 1:190–206.
• Lobock, BM., Rose, DJ., Plunkett, G., Rusin, M., Samojedny, A., Lehnherr, H., Yarmolinsky, MB., Blattner, FR. 2004. Genome of Bacteriophage P1. Journal of Bacteriology, 186/21,7032-7068.
• Silhavy, TJ.., Berman, ML., Enquis,t LW. 1984. Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Trends in genetics. Trends in Genetics, Vol1, 61.
• Snyder, L., Champness, W. 2007. Molecular genetics of bacteria. American Society for Microbiology,Washington,DC,USA.3rded.293-337.
• Thomason, LC., Costantino, N., Court, DL. 2014. E. coli Genome Manipulation by P1 Transduction. Current protocols in molecular biology. 79/1, 1.17.1-1.17.8.
• Yarmolinsky, MB., Sternberg, N. 1988. Bacteriophage P1. The Bacteriophages, vol 1.291–438.
• Zhu, XD., Sadowski, PD. 1995. Cleavage-dependent Ligation by the FLP Recombinase. Characterization of a mutant flp protein with an alteration in a catalytic amino acid. Journal of Biological Chemistry, 270/ 39: 23044 –23054.
• Zinder, ND. 1992. Forty years ago: the discovery of bacterial transduction. Genetics 132:291–294.
• Zinder, ND., Lederberg, J. 1952. Genetic exchange in Salmonella. J. Bacteriol. 64:679–699.