Dondurulmuş-Çözdürülmüş Boğa Spermatozoon Baş Bölgesinde Bireysel Varyasyonun Landmark Tabanlı Geometrik Morfometri ile Karakterizasyonu

Abstract

Boğa fertilitesi ile ilişkili morfolojik varyasyonun anlaşılabilmesi için spermatozoon başı morfolojisinin doğru şekilde karakterize edilmesi büyük önem taşımaktadır. Bununla birlikte, konvansiyonel morfometrik yaklaşımlar büyük ölçüde doğrusal ölçümlere dayanmakta ve bu nedenle spermatozoon başındaki lokal şekil farklılıklarını gözden kaçırabilmektedir. Bu pilot çalışmada, landmark tabanlı geometrik morfometri yönteminin dondurulup çözdürülmüş boğa spermatozoon başı morfolojisindeki ince bireysel farklılıkları ortaya koyup koyamayacağı araştırılmıştır. Çalışmada klinik ve androlojik açıdan sağlıklı, fertil olduğu bilinen sekiz boğaya ait arşivlenmiş dondurulmuş sperma örnekleri değerlendirilmiştir. Sperma örnekleri çözdürüldükten ve Eosin Y ile boyandıktan sonra morfolojik olarak normal 200 spermatozoon başının görüntüsü elde edilmiş ve spermatozoon baş konturu boyunca 15 landmark ve semilandmark noktası işaretlenmiştir. Konum, yönelim ve boyuttan kaynaklanan varyasyonu ortadan kaldırmak amacıyla Generalize Procrustes Analizi uygulanmıştır. Sentroid büyüklüğü ve şekil farklılıkları Procrustes varyans analizi ile değerlendirilirken, allometrik etkinin belirlenmesi ve Principal Component Analysis ile Discriminant Function Analysis öncesinde elimine edilmesi amacıyla çok değişkenli regresyon analizi kullanılmıştır. Bireyler arasında hem sentroid büyüklüğü hem de spermatozoon baş şekli bakımından istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar belirlenmiş (p < 0,0001) ve sentroid büyüklüğünün şekil üzerinde anlamlı bir etkisi olduğu saptanmıştır (p < 0,0001). Allometrik etkinin giderilmesinin ardından ilk dört temel bileşen, artık şekil varyasyonunun %74,72’sini açıklanmıştır. Başlıca morfolojik farklılıkların akrozomal bölgede ve akrozom–baş geçiş bölgesinde yoğunlaştığı, daha düşük düzeyde ise baş–orta parça birleşim bölgesinde görüldüğü belirlenmiştir. Morfolojik olarak bireyler arasında belirgin bir örtüşme bulunmasına rağmen, diskriminant analizinde çapraz doğrulama sonucunda yaklaşık %65 oranında doğru sınıflandırma elde edilmiş ve bu durum bireyler arasında orta düzeyde bir morfolojik ayrışma olduğu gösterilmiştir. Bu bulgular, landmark tabanlı geometrik morfometri yönteminin morfolojik olarak normal dondurulup çözdürülmüş boğa spermatozoonlarında ince ve anatomik olarak lokalize şekil varyasyonlarını ortaya koyabildiğini göstermektedir. Bu yaklaşım, konvansiyonel morfometrik yöntemlerin ötesinde tamamlayıcı bilgiler sunmakta ve spermatozoon baş şeklinin fonksiyonel özellikler ile fertiliteye ilişkin parametrelerle birlikte değerlendirileceği gelecekteki çalışmalar için metodolojik bir temel oluşturacağı düşünülmektedir.

Keywords

• Boğa sperması
• geometrik morfometri
• kriyoprezervasyon
• landmark analizi
• Procrustes analizi
• spermatozoon morfolojisi

Ethical Statement

Bu çalışma için sperma alımı yapılmamış ve hayvanlar üzerinde herhangi bir uygulama gerçekleştirilmemiştir. Çalışma protokolü, Dokuz Eylül Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Protokol No: 39/2026).

Thanks

Bu çalışmada kullanılan dondurulmuş sperma payetlerini sağlayan EGEVET Boğa İstasyonu’na (İzmir, Türkiye) teşekkür ederiz

Characterizing Individual Variation in Frozen-Thawed Bull Sperm Heads Using Landmark- Based Geometric Morphometrics

Abstract

Accurate characterization of sperm-head morphology is essential for understanding morphological variation associated with bull fertility. However, conventional morphometric approaches largely rely on linear measurements and may overlook localized shape differences within the sperm head. This pilot study investigated whether landmark-based geometric morphometrics could detect subtle individual differences in frozen-thawed bull sperm-head morphology. Archived frozen semen samples from eight clinically and andrologically healthy, fertile bulls were evaluated. Following thawing and Eosin Y staining, sperm heads were photographed and 15 points were digitized along the sperm-head outline. Generalized Procrustes Analysis was used to remove variation related to position, orientation, and scale. Differences in centroid size and shape were assessed using Procrustes analysis of variance, while multivariate regression was used to evaluate and remove the allometric effect before Principal Component Analysis and Discriminant Function Analysis. Significant differences among individuals were detected for both centroid size and sperm-head shape (p<0.0001), and centroid size had a significant effect on shape (p<0.0001). After correction for allometry, the first four principal components explained 74.72% of residual shape variation. The main morphological differences were concentrated in the acrosomal region and acrosome-head transition and, to a lesser extent, at the head-midpiece junction. Despite considerable overlap among individuals in morphospace, discriminant analysis yielded an overall cross-validated correct classification rate of approximately 65%. These findings demonstrate that landmark-based geometric morphometrics can detect subtle, anatomically localized variation in morphologically normal frozen-thawed bull spermatozoa and provide complementary information beyond conventional morphometry.

Keywords

• Bull spermatozoa
• cryopreservation
• geometric morphometrics
• landmark analysis
• procrustes analysis
• sperm-head morphology

Ethical Statement

This study was approved by the Dokuz Eylül University Animal Experiments Local Ethics Committee (17.06.2026, 39/2026 Number Ethics Committee Decision). In addition, the authors declared that Research and Publication Ethical rules were followed.

Thanks

The authors gratefully acknowledge the EGEVET Bull Station (İzmir, Türkiye) for providing the archived frozen semen samples used in this study.

References

1. Benko, F., Mohammadi-Sangcheshmeh, A., Ďuračka, M., Lukáč, N., & Tvrdá, E. (2022). In vitro versus cryo-induced capacitation of bovine spermatozoa, part 1: Structural, functional, and oxidative similarities and differences. PLOS ONE, 17(10), e0276683. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0276683
2. Bodu, M., Hitit, M., Sari, A., Kirbas, M., Bulbul, B., Ataman, M. B., Bucak, M. N., Parrish, J., Kaya, A., & Memili, E. (2025). Sperm cellular and nuclear dynamics associated with ram fertility. Frontiers in Veterinary Science, 12, 1577004. https://doi.org/10.3389/ fvets.2025.1577004
3. Chicaiza-Cabezas, N., Garcia-Herreros, M., & Aponte, P. M. (2023). Germplasm cryopreservation in bulls: Effects of gonadal tissue type, cryoprotectant agent, and freezing-thawing rates on sperm quality parameters. Cryobiology, 110, 24-35. https://doi. org/10.1016/j.cryobiol.2023.01.001
4. Gravance, C. G., Casey, M. E., & Casey, P. J. (2009). Pre-freeze bull sperm head morphometry related to post-thaw fertility. Animal Reproduction Science, 114, 81-88. https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2008.09.014
5. Gürler, H., Malama, E., Heppelmann, M., Calisici, O., Leiding, C., Kastelic, J. P., & Bollwein, H. (2016). Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology, 86, 562-571. https://doi. org/10.1016/j.theriogenology.2016.02.007
6. Klingenberg, C. P. (2011). MorphoJ: An integrated software package for geometric morphometrics. Molecular Ecology Resources, 11, 353-357. https://doi. org/10.1111/j.1755-0998.2010.02924.x
7. Klingenberg, C. P., Barluenga, M., & Meyer, A. (2002). Shape analysis of symmetric structures: Quantifying variation among individuals and asymmetry. Evolution, 56(10), 1909-1920.
8. Min, C.-G., Ma, X., Wang, Y.-C., Zhong, C.-K., Yuan, C.-S., Zhang, K.-Y., Zhan, C.-L., Hou, S.-K., Wang, X.-H., Wang, J., Zhao, J., Fang, Y., Liu, H.-Y., Ding, H., Guo, J., & Lu, W.-F. (2024). The effects of repeated freezing and thawing on bovine sperm morphometry and function. Cryobiology, 115, 104892. https://doi. org/10.1016/j.cryobiol.2024.104892

9. Mofadel, H. A., Hussein, H. A., Abd-Elhafee, H. H., & El-Sherry, T. M. (2024). Impact of various cryo-preservation steps on sperm rheotaxis and sperm kinematics in bull. Scientific Reports, 14(1), 11403. https://doi. org/10.1038/s41598-024-61617-y
10. Nagy, S., Johannisson, A., Wahlsten, T., Ijäs, R., Andersson, M., & Rodríguez-Martínez, H. (2013). Sperm chromatin structure and sperm morphology: Their association with fertility in AI-dairy Ayrshire sires. Theriogenology, 79, 1153-1161. https://doi. org/10.1016/j.theriogenology.2013.02.011
11. Palacín, I., Santolaria, P., Alquezar-Baeta, C., Soler, C., Silvestre, M. A., & Yániz, J. (2020). Relationship of sperm plasma membrane and acrosomal integrities with sperm morphometry in Bos taurus. Asian Journal of Andrology, 22, 578-582. https://doi. org/10.4103/aja.aja_2_20
12. Rodríguez-Martínez, H. (2013). Semen evaluation techniques and their relationship with fertility. Animal Reproduction, 10, 148-159.
13. Rohlf, F. J. (2017). TPSDig2 (Version 2.31). Department of Ecology and Evolution, State University of New York at Stony Brook.
14. Rubio-Guillén, J., González, D., Garde, J. J., Esteso, M. C., Fernández-Santos, M. R., Rodríguez-Gil, J. E., Madrid- Bury, N., & Quintero-Moreno, A. (2007). Effects of cryopreservation on bull spermatozoa distribution in morphometrically distinct subpopulations. Reproduction in Domestic Animals, 42, 354-357. https://doi.org/10.1111/j.1439-0531.2006.00788.x
15. Slice, D. E. (2007). Geometric morphometrics. Annual Review of Anthropology, 36, 261-281. https://doi. org/10.1146/annurev.anthro.34.081804.120613
16. Valverde, A., Arenán, H., Sancho, M., Contell, J., Yániz, J., Fernández, A., & Soler, C. (2016). Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: Variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology, 18, 851-857. https://doi.org/10.4103/1008- 682X.187579
17. Varea Sánchez, M., Bastir, M., & Roldan, E. R. S. (2013). Geometric morphometrics of rodent sperm head shape. PLOS ONE, 8(11), e80607. https://doi. org/10.1371/journal.pone.0080607
18. Villalobos-Leiva, A., & Benítez, H. A. (2020). Geometric morphometrics and its new applications in ecology and evolutionary biology. Part 2. International Journal of Morphology, 38, 1818-1836.
19. Yániz, J. L., Soler, C., & Santolaria, P. (2015). Computer assisted sperm morphometry in mammals: A review. Animal Reproduction Science, 156, 1-12. https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2015.03.002
20. Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., & Sheets, H. D. (2012). Geometric morphometrics for biologists: A primer (2nd ed.). Academic Press.