The Partial Purification and Characterization of Polyphenol Oxidase in Native Grape Kirmizi Kismisi Cultivar (Vitis vinifera L.) Grown in Iğdır Province

Öz

The native grape Kirmizi Kismisi cultivar was gathered from the Necefali village of Igdir province

in Turkey, and then caried into the laboratory and stored in deep-frozen at -20°C. Polyphenol oxidase (PPO) was

partial purified 5.45 times using the cold acetone precipitation from Kirmizi Kismisi Grape and was characterized.

50 gr of Kirmizi Kismisi Grape were placed in a porcelain mortar and pestled in order to decompose cell membranes.

The frozen Kirmizi Kismisi Grapes were homogenised by using a porcelain mortar in 100 mL of 50 mM sodium

acetate buffer (pH 5.0) containing 1% (w/v) polyethylene glycol (PEG). Then homogenate was percolated through

4-fold muslin and the resulting filtrate was santrifuged for 30 minutes at 10,000 rpm at 4°C. The supernatant

obtained after centrifugation was mixed with cold acetone as much as the volume of the supernatant in the ice

bath and the mixture was incubated overnight at 4°C for precipitation of proteins. After centrifugation at 10,000

rpm for 30 min at 4°C, the precipitate was redissolved in 20 mL 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0). Protein

concentration was determined according to the Lowry method. Protein concentrations of crude extract and acetone

precipitation were determined as 7.04 and 3.83 mg/mL, respectively. Optimum pH and temperature values were

found to be 6.0 and 20°C, respectively, using catechol as a substrate. In addition, some biochemical properties

such as Km and Vmax values were investigated. PPO activity was inhibited from ascorbic acid, citric acid, sodium

metabisulfite and benzoic acid and the IC50 for each inhibitor was calculated.The data obtained from this study

showed that this enzyme could be useful for food industrial purposes.

Anahtar Kelimeler

• Characterization,Kirmizi Kismisi,polyphenol oxidase,partial purification,inhibition

Iğdır İlinin Yerel Üzümü Kırmızı Kişmişi (Vitis vinifera L.) Çeşidinden Polifenol Oksidazın Kısmi Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Öz

Yerel üzüm çeşidi Kırmızı Kişmişi, Türkiye’nin Iğdır ilinin Necefali köyünden toplandı ve daha sonra

laboratuvara taşındı ve -20 °C’de dondurularak saklandı. Kırmızı Kişmişi’den polifenol oksidaz aseton çöktürmesi

yöntemi kullanılarak 5.45 kat kısmi olarak saflaştırıldı ve karakterize edildi. 50 gr Kırmızı kişmiş üzümü hücre

zarlarını parçalamak için porselen havanda dövüldü. Dondurulmuş Kırmızı kişmişi üzümü %1 polietilen glikol

(PEG) içeren 100 mL 50 mM sodyum asetat tamponuyla (pH 5.0) homojenize edildi. Daha sonra homojenat, 4

katlı tulbentten süzüldü ve elde edilen süzüntü 4°C’de 30 dakika 10 000 rpm’de santrifüjelendi. Santrifüjden sonra

elde edilen süpernatant, buz banyosunda süpernatanın hacmine kadar soğuk aseton eklendi ve karışım proteinlerin

çökeltilmesi için gece boyunca 4°C’de inkübe edildi. 4°C’de 30 dakika 10 000 rpm’de santrifüj edildikten sonra,

çökelti 20 mL 50 mM sodyum asetat tamponu (pH 5.0) içinde yeniden çözündürüldü. Protein konsantrasyonu

Lowry yöntemine göre belirlendi. Ham enzim özütü ve aseton çöktürmesi sonrası protein konsantrasyonları

sırasıyla 7.04 ve 3.83 mg/mL olarak belirlendi. Katekol substratı kullanılarak, optimum pH ve sıcaklık değerleri

sırasıyla 6.0 ve 20°C bulundu. Buna ek olarak, Km ve Vmaks değerleri gibi bazı biyokimyasal özellikler araştırıldı.

PFO enzimi için askorbik asit, sitrik asit, sodyum metabisülfit ve benzoik asit ile inhibisyon çalışmaları yapılmış,

herbir inhibitör için IC50 hesaplanmıştır. Bu çalışmadan elde edilen veriler, bu enzimin gıda endüstrisi için yararlı

olabileceğini gösterdi.

Anahtar Kelimeler

• Kırmızı kişmişi,kısmi saflaştırma,karakterizasyon,polifenol oksidaz,ïnhibisyon

Kaynakça

1. Önez Z, 2006. Üzümden (Vitis Vinifera L.) İzole Edilen Polifenol Oksidaz Enziminin Özelliklerinin Belirlenmesi. Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi.
2. Khan AA, Akhtar S, Husain Q, 2006. Direct immobilization of polyphenol oxidases on celite 545 from ammonium sulphate fractionated proteins of potato (solanum tuberosum). Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 40:58-63.
3. Bravo K, Osorio E, 2016. Characterization of polyphenol oxidase from Cape gooseberry (Physalis peruviana L.) fruit. Food Chemistry, 197:185–190.
4. Turan P, 2005. Ocimum basilicum L.’den Elde Edilen Polifenol Oksidaz Enziminin Saflaştırılması, Kinetik ve Elektroforotik Özelliklerinin İncelenmesi. Balıkesir Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi.
5. Ülker-Yerlitürk F, Arslan O, Sınan S, Gencer N, Özensoy Ö, 2008. Characterızatıon Of Polyphenoloxıdase from Wıld Pear (Pyrus Elaegrıfolıa). Journal of Food Biochemistry, 32:368–383.
6. Öz F, Colak A, Özel A, Sağlam-Ertunga N, Sesli E, 2013. Purification and Characterization of A Mushroom Polyphenol Oxidase and Its Activity in Organic Solvents. Journal of Food Biochemistry, 37:36–44.
7. Yoruk R, Marshall MR, 2003. Physicochemical properties and function of plant polyphenoloxidase:a review. Journal of Food Biochemistry, 27;361–422.Kolcuoğlu Y, 2012. Purification and comparative characterization of monophenolase and diphenolase activities from a wild edible mushroom (Macrolepiota gracilenta). Process Biochemistry, 47;2449–2454.
8. Mason HS, 1948. Chemistry of melanin Mechanism of oxidation of 3,4-dihydroxyphenylalanine by tyrosinase. Journal of Biological Chemistry, 72;83–99.

9. Prota G, 1988. Progress in the chemistry of melanins and related metabolites. Medicinal Research Review, 8;525–556.
10. Mathewson PR, 2000. Enzymes. Eagen Press Handbook Series, 37-38.
11. Mcweeny DJ, 1974. The chemistry of non-enzymatic browning in foods and its control by sulphites. Journal of the Science of Food and Agriculture, 25;735.
12. Labuza TP, Lillemo JH, Taoukis PS, 1992. Inhibition of polyphenol oxidase by proteolytic enzymes. Fruit Processing, 2;9-13.
13. Çelik H, 2014. Üzümün besin değeri. Türkiye Tohumcular Birliği Dergisi.
14. Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı Tarımsal, Ekonomi ve Politika Geliştirme Enstitüsü, 2015.
15. Aydemir T, 2004. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chemistry, 87;59–67.
16. Özen A, Colak A, Dincer B, Güner S, 2004. A diphenolase from persimmon fruits (Diospyros kaki L., Ebenaceae). Food Chemistry, 85;431–437.
17. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ, 1951. Protein Measurement With The Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry, 193;265-275.
18. Espin JC, Morales M, Varon R, Tudela J, Garcia-Canovas F, 1995. A continuous spectrophotometric method for determining the monophenolase and diphenolase activities of apple polyphenol oxidase. Analytical Biochemistry, 43;2807-2812.
19. Galeazzi MAM, Sgarbieri VCJ, 1981. Substrate Specificity and İnhibition of Polyphenoloxidase from a Dwarf Variety of Banana (Musa Cavendishii, L.). Journal Of Food Science, 46;1404-1406.
20. Colak A, Özen A, Dincer B, Güner S, Ayaz AF, 2005. Diphenolases from Two Cultivars of Cherry Laurel (Laurocerasus Officinalis Roem.) Fruits at Early Stage of Maturation. Food Chemistry, 90;801-807.
21. Dincer B, Colak A, Aydin N, Kadioglu A, Güner S, 2002. Characterization of Polyphenoloxidase from Medlar Fruits (Mespilus Germanica L. Rosaceae). Food Chemistry, 77;1-7.
22. Lineweaver H, Burk D, 1934. The Determination of Enzyme Dissociation Constant. Journal of American Chemical Society, 56;658-661.
23. Kuyumcu İ, 2014. Yabani Ve Yenilebilir Bir Mantar Olan Lactarıus Eucalyptı O. K. Mıll & R. N. Hılton’ dan Polifenol Oksidazın Saflaştırılması ve Karakterizasyonu,” Karadeniz Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi.
24. Tozak KÖ, 2013. Nevşehir Patatesinden (Solanum Tuberosum L.)Polifenoloksidaz Enziminin Afinite Kromatografisi İle Saflaştırılarak Kinetik Ve Elektroforetik Özelliklerinin İncelenmesi, Aksaray Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi.
25. Dedeoğlu N, 2009. Yenilebilir Mantar Türlerinden Polifenol Oksidaz Enziminin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu, Balıkesir Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi.
26. Özel A, Colak A, Arslan O, Yildirim M, 2010. Purification and characterisation of a polyphenol oxidase from Boletus erythropus and investigation of its catalytic efficiency in selected organic solvents. Food Chemistry, 119;1044–1049.