LLL vitro capacitation of frozen-thawed bull semen by different capacitating agents

Abstract

In this study, the effects of heparin (Istgroup), caffein plus heparin (2ndgroup) and caffein plus calcium10nophare (3rdgroup) oni/1vi/rocapacitation of frozen-thawedbull semen were investigated. For this purpase, in the first group, threedosages of heparin (ı O. 25,iDOJJg/ml) and three incubation time (5, 15, 60 min.) were cxamined. In the second group, 5.iO and 15mM concentrationscombined with D.ı,D.2, 0.3 JJM calcium ionophore. Af ter induction of capacitationhosphatielylcholine(LPC) was added to medium to induce acrosame reaction for a period of 15 minutes. To determine the reactionanel viability, sperIlıatozoa were stained by dual staining method using trypan blue and Giemsa. Four categories of spermatozoa wereidentifieel and counted: 1- Intact acrosame, live; 2- Intact acrosame, dead; 3- Detached acrosame, live; 4- Detaehed acrosame. deael.[n the first, second and third groups the highest results were 25.466% (l DOJJg/mlJJg/mlspermatozoa increased as the heparin dosage and incubation period inereased in the first group. A synergisticeffect of caffein plusheparin anel caffein plus calcium ionophore were observed in our study. The total dosages of eapacitating agents increased. mean proportions of capacitated spermatozoaincreased in the second and third groups

Keywords

• Bul]
• caffein
• calcium ionophore
• heparin
• i/1vi/roeapacitation

Dondurulmuş boğa spermasının değişik kapasitör maddelerle in vitro kapasitasyonu

Abstract

Çalışmada, heparin (I. grup), heparin+kafein (2. grup) ve kafein+kalsiyum ionofonın (3. grup) i/1 vi/ro spermatozoon kapasitasyonu üzerine etkileri incelendi. Bu amaçla sperma ı. grupta iO, 25 ve iOC) JJg/ml heparin ile 5, 15 ve 60 dakikalık süreler için inkübasyona bırakılırken 2. grupta 5, ıO, ı5 mM kafein, O, 5, 10, 25 JJg/ml heparin ile ve 3. grupta O, 5, 10 mM kafein. O.ı. 0.2. 0.3 JJM kalsiyum iyonofor ile kombine edilerek kuııanıldı. Kapasitasyonun sağlanmasından sonra spermaya 100 JJg/ml li7.Ofosfatidilkolin (LPC) ilave edilerek akrazam reaksiyonu (AR) indüklendi. Oluşan reaksiyonun ve spermatozoonların canlılıklarının belirlenebilmesi için trypan blue ve Giemsa ile ikili boyama yapıldı. Bu boyama ile spermatozoonların canlılıkları ve reaksiyana girmeleri gruplandırılarak değerlendirildi. Gruplar: ı- Canlı, reaksiyon (-); 2- ÖLÜ.reaksiyon (-); 3- Canlı. reaksiyon (+); 4- ÖIli, reaksiyon (+) olarak adlandırıldılar. Buna göre, her üç grupta elde edilen en yüksek kapasitasyana uğramış spennatozoon oranları ı. grupta (100 JJg/ml heparinle 60 dakika inkübasyon) %25.466, 2. grupta (15 mM kafein+25 JJg/ml heparin) %28.440 ve 3. grupta (10 mM kafein+0.3 JJM kalsiyum ionofor) %29.908 olarak bulundu. İlk grupta kuııanılan heparin konsantrasyonunun ve artan inkübasyon süresinin kapasite alımış spermatozoon oranlannı arttırdığı gözlendi. İkinci ve üçüncü gruplarda ise kullanılan kapasitör maddelerin birbirlerinin etkilerini destekledikleri ve toplam konsantrasyonlarımn artmasına bağlı olarak kapasite ollııılŞ sperımıtozoon oranlarının yükseldiği belirlendi.

Keywords

• Boğa
• heparin
• i/1vi/rokapasitasyon
• kafein
• kalsiyum iyonofor

References

1. ı. Aalseth EP, Saaeke rosomal evalaaliOlı oL bovine spemı. G,mıete Res.15,73- Vilal slaiııing wıd ac- Aoyagi Y, Fujii K, Iwazumi Ono H (1988): nifecls ol two Irealmenls (m .ıemeıı .liom dir fereni balls011in vitro ferlilizatiOlı resalıs oL bovine oocy- les. Theriogenology, Hellin ME, Hawkins Y, Furudate
2. Ax RL (1996): Monocionalanıibodl' deıectioıı oj' hepariıı- binding proıeins on sperm correspoııds M, FukuiY, ,IN, Vanderboom RJ, lo increased.11'1'- lilily of balls. J Anim Sci, 74,i73-i82. BloHnerS, Nehring ferences viıro: Relalionship lo .lımiliıy. Theriogeno1ogy. , 619
3. Calvete JJ, DostalovaZ, Sanz L, Aderman Töpfer-Petersen dO/nain oj'boar spenn(ldheins. Cao X, Hen K, WangY, Wang aminobatyricacid, progeslerone acrosome minaıion reseenee microscopy. Anim Reprad Sci, 49, 225-234. Cross LN, Meizel S (1989): MeıhodsFır
4. CN (1986):LLLviı'o cap(lcilillioıı oııd ,lE, Hall HA, Blue HJ, WilkcrCE (1993): Ca- membraııe changes oııd proloııged via/)ilily Parrish heparin and chondrioıiıı sul/elle 011ıhe acro.lıome reacıioıı
5. JL; First NL(I~85): E/teclol and ferlililyof bovine spen~ il; viıro. Theriqgenoıogy. , 549. Parrish n,Susko-Parrish TL, First NI~(I989): Ca- pacitalion o/' bOi'ine sperm by heparin: /nhilı'iıory e/f,ecı of glucose and ro/e ot inıracel/uar pH. Biol Reprocl, 41. 683- i Parrish i n,Susko-Parrish ~L, Winer MA, First NL (1988)
6. Capacilalioıı otboi'inespermbyhep(lırilı. Biol Rep- rocl,38,1171-1180. i
7. Saeki K, Kato H, Hosoi Y, Miyake M, Uts~mi K, Iritani A (199 i): Early morphological evenls of iıııviıro ferıilized bovineoocyıes with ./i'ozen-ı?awed sperm/lıoz.oa. Theri- ogenology, 35, ]05J-1058.
8. Sidhu KS, Dhindsa.TS, Guraya ining procedure for deıecling ıhe Irue acrosl;>IJ1ereacıion in SS (1992)1: A simp/e sw- bu/ralo (Buhalus huba/is) spenl1alolOa. Biot?Ch Hislüchem, , 35-39. Sidhu KS, Guraya ology of capacilalion and acroiwme reactiOl( in mml1maliwl spermatozoa. Int Rev Cyıol, 118, 231-280. Spungin

9. E, Roea .T, Coy' P, Pastor LM (1993): mologous in vilro.lerıilimtion
10. (',d'hoar spenl J1(I OZOO Mol Reprocl Dcv. 36. 84-88. S, FooteRH(ı993): Boviııe oocvle de- velopmentfol/owiııg capacitatiOlı procedures.MolıReprocl Dev. 134.94-1 DO. i Geliş ıarihi: 20.3.2002/ Kohul tarihi: 25.4.12002 i