Pazaryeri’nde (Bilecik) yetiştirilen Humulus lupulus L. (Şerbetçi otu) çeşitlerinin ISSR-PCR Yöntemiyle genetik farklılık analizi

Abstract

Genetic difference analysis of Humulus lupulus L. (Hop) cultivars grown in Pazaryeri (Bilecik) using the ISSR-PCR method İsmail POYRAZ1, 2*, Burcu ÖZMEN3, Kezban DOĞCA1 ORCID: 0000-0003-3651-5885; 0000-0003-3667-1597; 0009-0003-0631-1168 1 Bilecik Seyh Edebali University, Faculty of Science, Molecular Biology and Genetics Department, 11100, Bilecik, Turkey 2 Bilecik Seyh Edebali University, Biotechnology Application and Research Centre, 11100, Bilecik, Turkey 3 Bilecik Seyh Edebali University, Graduate School, Biotechnology, 11100, Bilecik, Turkey Abstract Humulus lupulus L. (hop) is an important industrial plant grown only in the Bilecik-Pazaryeri district in Turkey. The most common usage area is the beer industry. It is preferred as a flavour and aroma raw material because it contains secondary metabolites. Different H. lupulus varieties are cultivated in the villages in Pazaryeri. Besides the registered varieties used by farmers, it is seen that some farmers also prefer unknown H. lupulus seeds in production. This study aimed to determine the genetic diversity of 18 H. lupulus varieties and samples cultivated in different locations for the beer industry in Pazaryeri using the ISSR (inter simple sequence repeat)-PCR method. DNA isolations were performed using a commercial kit from plant leaves grounded in liquid nitrogen. 25 ISSR primers were tested for DNA amplifications and 10 primers that produced reproducible DNA fragments were used for genetic diversity analysis. PIC (polymorphism information content) value and PCoA (principal coordinate analysis) were calculated for each primer. DNA bands obtained from PCR products electrophoresed in agarose gel were photographed. Band profiles were compared using the Phoretix1DPro program and binary data analysis was performed as present (1) / absent (0). Jaccard similarity and distance matrixes were created with UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) and a dendrogram showing genetic diversity was drawn using the MEGA 11 software. It was determined that different H. lupulus varieties grown in the same locations show location-dependent (together) branching in the dendrogram. While it is expected that registered varieties have separate branching from each other in the dendrogram, it was seen that different H. lupulus varieties grown in the same locations show location-dependent (together) branching. Keywords: hop, genetic diversity, ISSR-PCR method ----------  ---------- Pazaryeri’nde (Bilecik) yetiştirilen Humulus lupulus L. (Şerbetçi otu) çeşitlerinin ISSR-PCR Yöntemiyle genetik farklılık analizi Özet Humulus lupulus L. (şerbetçi otu), Türkiye’de sadece Bilecik-Pazaryeri ilçesinde yetiştirilen önemli bir endüstriyel bitkidir. En yaygın kullanım alanı bira endüstrisidir. İçerdiği sekonder metabolitler nedeniyle tat ve aroma verici ham madde olarak tercih edilir. Pazaryeri’ndeki köylerde farklı H. lupulus çeşitlerinin tarımı yapılmaktadır. Çiftçilerin kullandığı tescilli çeşitlerin yanında bazı adı bilinmeyen H. lupulus tohumlarının da üretimde tercih edildiği görülmektedir. Bu çalışmada, Pazaryeri’nde bira endüstrisine yönelik farklı lokasyonlarda tarımı yapılan 18 H. lupulus çeşit ve örneğin ISSR (basit dizi tekrarları arası)-PZR yöntemiyle genetik çeşitliliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. DNA izolasyonları, sıvı azotta öğütülmüş bitki yapraklarından ticari kit kullanılarak gerçekleştirilmiştir. DNA çoğaltımları için 25 ISSR primeri test edilmiş ve tekrarlanabilir DNA fragmanları üreten 10 tane primer genetik çeşitlilik analizi için kullanılmıştır. Her primer için PIC (polymorphism information content) değeri ve PCoA (temel koordinat analizi) hesaplanmıştır. Agaroz jel elektroforezi yapılan PZR ürünlerine ait DNA bantları fotoğraflanmıştır. Bant profilleri Phoretix1DPro program kullanılarak karşılaştırılmış ve var (1) / yok (0) ikili veri analizi yapılmıştır. UPGMA (aritmetik ortalama ile ağırlıksız çift grup yöntemi) ile Jaccard benzerlik ve mesafe matrisi oluşturulmuş ve MEGA 11 yazılımı kullanılarak genetik çeşitliliği gösteren dendrogram çizilmiştir. Tescilli çeşitlerin dendrogramda birbirinden ayrı dallanma göstermesi beklenirken, aynı lokasyonda yetişen farklı H. lupulus çeşitlerinin lokasyona bağlı (birlikte) dallanma gösterdiği belirlenmiştir. Anahtar kelimeler: şerbetçi otu, genetik çeşitlilik, ISSR-PCR yöntemi 1. Introduction 2. Materials and methods 2.1 Plant materials 2.2 DNA isolation 2.3 ISSR-PCR analysis 2.4 Data analysis 3. Results and discussion References [1]

Keywords

• hop
• genetic diversity
• ISSR-PCR method

Genetic difference analysis of Humulus lupulus L. (Hop) cultivars grown in Pazaryeri (Bilecik) using the ISSR-PCR method

Abstract

Genetic difference analysis of Humulus lupulus L. (Hop) cultivars grown in Pazaryeri (Bilecik) using the ISSR-PCR method İsmail POYRAZ1, 2*, Burcu ÖZMEN2, Kezban DOĞCA1 ORCID: 0000-0003-3651-5885; 0000-0003-3667-1597; - 1 Bilecik Seyh Edebali University, Faculty of Science, Molecular Biology and Genetics Department, 11100, Bilecik, Turkey 2 Bilecik Seyh Edebali University, Biotechnology Application and Research Centre, 11100, Bilecik, Turkey Abstract Humulus lupulus L. (hop) is an important industrial plant grown only in the Bilecik-Pazaryeri district in Turkey. The most common usage area is the beer industry. It is preferred as a flavour and aroma raw material because it contains secondary metabolites. Different H. lupulus varieties are cultivated in the villages in Pazaryeri. Besides the registered varieties used by farmers, it is seen that some farmers also prefer unknown H. lupulus seeds in production. This study aimed to determine the genetic diversity of 18 H. lupulus varieties and samples cultivated in different locations for the beer industry in Pazaryeri using the ISSR (inter simple sequence repeat)-PCR method. DNA isolations were performed using a commercial kit from plant leaves grounded in liquid nitrogen. 25 ISSR primers were tested for DNA amplifications and 10 primers that produced reproducible DNA fragments were used for genetic diversity analysis. PIC (polymorphism information content) value and PCoA (principal coordinate analysis) were calculated for each primer. DNA bands obtained from PCR products electrophoresed in agarose gel were photographed. Band profiles were compared using the Phoretix1DPro program and binary data analysis was performed as present (1) / absent (0). Jaccard similarity and distance matrixes were created with UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) and a dendrogram showing genetic diversity was drawn using the MEGA 11 software. It was determined that different H. lupulus varieties grown in the same locations show location-dependent (together) branching in the dendrogram. While it is expected that registered varieties have separate branching from each other in the dendrogram, it was seen that different H. lupulus varieties grown in the same locations show location-dependent (together) branching. Keywords: hop, genetic diversity, ISSR-PCR method ----------  ---------- Pazaryeri’nde (Bilecik) yetiştirilen Humulus lupulus L. (Şerbetçi otu) çeşitlerinin ISSR-PCR Yöntemiyle genetik farklılık analizi Özet Humulus lupulus L. (şerbetçi otu), Türkiye’de sadece Bilecik-Pazaryeri ilçesinde yetiştirilen önemli bir endüstriyel bitkidir. En yaygın kullanım alanı bira endüstrisidir. İçerdiği sekonder metabolitler nedeniyle tat ve aroma verici ham madde olarak tercih edilir. Pazaryeri’ndeki köylerde farklı H. lupulus çeşitlerinin tarımı yapılmaktadır. Çiftçilerin kullandığı tescilli çeşitlerin yanında bazı adı bilinmeyen H. lupulus tohumlarının da üretimde tercih edildiği görülmektedir. Bu çalışmada, Pazaryeri’nde bira endüstrisine yönelik farklı lokasyonlarda tarımı yapılan 18 H. lupulus çeşit ve örneğin ISSR (basit dizi tekrarları arası)-PZR yöntemiyle genetik çeşitliliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. DNA izolasyonları, sıvı azotta öğütülmüş bitki yapraklarından ticari kit kullanılarak gerçekleştirilmiştir. DNA çoğaltımları için 25 ISSR primeri test edilmiş ve tekrarlanabilir DNA fragmanları üreten 10 tane primer genetik çeşitlilik analizi için kullanılmıştır. Her primer için PIC (polymorphism information content) değeri ve PCoA (temel koordinat analizi) hesaplanmıştır. Agaroz jel elektroforezi yapılan PZR ürünlerine ait DNA bantları fotoğraflanmıştır. Bant profilleri Phoretix1DPro program kullanılarak karşılaştırılmış ve var (1) / yok (0) ikili veri analizi yapılmıştır. UPGMA (aritmetik ortalama ile ağırlıksız çift grup yöntemi) ile Jaccard benzerlik ve mesafe matrisi oluşturulmuş ve MEGA 11 yazılımı kullanılarak genetik çeşitliliği gösteren dendrogram çizilmiştir. Tescilli çeşitlerin dendrogramda birbirinden ayrı dallanma göstermesi beklenirken, aynı lokasyonda yetişen farklı H. lupulus çeşitlerinin lokasyona bağlı (birlikte) dallanma gösterdiği belirlenmiştir. Anahtar kelimeler: şerbetçi otu, genetik çeşitlilik, ISSR-PCR yöntemi 1. Introduction 2. Materials and methods 2.1 Plant materials 2.2 DNA isolation 2.3 ISSR-PCR analysis 2.4 Data analysis 3. Results and discussion References [1]

Keywords

• hop
• genetic diversity
• ISSR-PCR method

References

1. [1] Paguet, A. S., Siah, A., Lefèvre, G., Moureu, S., Cadalen, T., Samaillie, J., ... & Rivière, C. (2023). Multivariate analysis of chemical and genetic diversity of wild Humulus lupulus L.(hop) collected in situ in northern France. Phytochemistry, 205, 113508. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2022.113508
2. [2] Baytop, T. (1999). Türkiye'de bitkiler ile tedavi: geçmişte ve bugün. Nobel Tıp Kitabevleri.
3. [3] Koday, S. (2000). Türkiye'de kivi üretimi/yield of kiwi in Turkey. Doğu Coğrafya Dergisi, 6(3), 103-122.
4. [4] Carbone, K., & Gervasi, F. (2022). An updated review of the genus Humulus: A valuable source of bioactive compounds for health and disease prevention. Plants, 11(24), 3434. doi: 10.3390/plants11243434.
5. [5] Zugravu, C. A., Bohiltea, R. E., Salmen, T., Pogurschi, E., & Otelea, M. R. (2022). Antioxidants in hops: Bioavailability, health effects and perspectives for new products. Antioxidants, 11(2), 241. doi: 10.3390/antiox11020241.
6. [6] Rossini, F., Virga, G., Loreti, P., Iacuzzi, N., Ruggeri, R., & Provenzano, M. E. (2021). Hops (Humulus lupulus L.) as a novel multipurpose crop for the Mediterranean region of Europe: Challenges and opportunities of their cultivation. Agriculture, 11(6), 484. https://doi.org/10.3390/agriculture11060484
7. [7] Bocquet, L., Sahpaz, S., Hilbert, J. L., Rambaud, C., & Rivière, C. (2018). Humulus lupulus L., a very popular beer ingredient and medicinal plant: Overview of its phytochemistry, its bioactivity, and its biotechnology. Phytochemistry reviews, 17(5), 1047-1090.
8. [8] Kishimoto, T., Teramoto, S., Fujita, A., & Yamada, O. (2022). Evaluation of components contributing to the international bitterness unit of wort and beer. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 80(1), 53-61. https://doi.org/10.1080/03610470.2021.1878684

9. [9] Korpelainen, H., & Pietiläinen, M. (2021). Hop (Humulus lupulus L.): Traditional and present use, and future potential. Economic botany, 75(3-4), 302-322.
10. [10] Başkaya, Z. (2011). The Geographical Foundations of Hops Production in Bilecik, Eas. Geogr. Rev, 25(16), 209-230.
11. [11] Luo, J., Pan, Q., Chen, Y., Huang, W., Chen, Q., Zhao, T., ... & Lu, B. (2024). Storage stability and degradation mechanism of xanthohumol in Humulus lupulus L. and beer. Food Chemistry, 437, 137778. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.137778
12. [12] Alonso-Esteban, J. I., Pinela, J., Barros, L., Ćirić, A., Soković, M., Calhelha, R. C., ... & Ferreira, I. C. (2019). Phenolic composition and antioxidant, antimicrobial and cytotoxic properties of hop (Humulus lupulus L.) Seeds. Industrial Crops and Products, 134, 154-159.
13. [13] Sözen, E., & Yücel, E. (2015). Determination of genetic relationships between some endemic Salvia species using RAPD markers. Biyolojik Çeşitlilik ve Koruma, 8(3), 248-253.
14. [14] Calvi, A., Aci, M. M., Lupini, A., & Preiti, G. (2023). Morphological and genetic analysis of wild hop (Humulus lupulus L.) germplasm from Calabria Region in South Italy. Agronomy, 13(1), 252. https://doi.org/10.3390/agronomy13010252
15. [15] Hilooğlu, M., Poyraz, İ., Poyraz, İ., Ataşlar Göymen, E., & Sözen, E. (2016). Genetic relationships among some Turkish Petrorhagia (Ser.) Link (Caryophyllaceae) taxa using ISSR markers. Phytotaxa, 272(2). https://doi.org/10.11646/phytotaxa.272.2
16. [16] Dağ., E. Yıldırım, N., & Korkmaz, M. (2023). Erzincan ve çevresinde yayılış gösteren Astragalus L. türlerinin genetik çeşitliliğinin ISSR yöntemi ile belirlenmesi. Biyolojik Çeşitlilik ve Koruma, 16(3), 203-209. https://doi.org/10.46309/biodicon.2023.1255384
17. [17] De Riek, J., Calsyn, E., Everaert, I., Van Bockstaele, E., & De Loose, M. (2001). AFLP based alternatives for the assessment of distinctness, uniformity and stability of sugar beet varieties. Theoretical and applied genetics, 103, 1254-1265. https://doi.org/10.1007/s001220100710.
18. [18] Peakall, R. O. D., & Smouse, P. E. (2006). GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular ecology notes, 6(1), 288-295. https://doi.org/10.1111/j.1471-8286.2005.01155.x
19. [19] Şahin, G., & Erbilen, S. Ü. (2012). Türkiye’de Yetiştirilen Keyf Bitkiler İçerisinde Özel Bir Tür: Şerbetçiotu (Humulus lupulus L.). Zeitschrift für die Welt der Türken, 4(3), 339.
20. [20] Van Holle, A., Muylle, H., Ruttink, T., Van Landschoot, A., Haesaert, G., Naudts, D., ... & Roldán-Ruiz, I. (2019). Single nucleotide polymorphisms and biochemical markers as complementary tools to characterize hops (Humulus lupulus L.) in brewing practice. Journal of agricultural and food chemistry, 67(13), 3761-3771.
21. [21] Patzak, J., Nesvadba, V., Henychová, A., & Krofta, K. (2010). Assessment of the genetic diversity of wild hops (Humulus lupulus L.) in Europe using chemical and molecular analyses. Biochemical Systematics and Ecology, 38(2), 136-145.
22. [22] Ocvirk, M., Nečemer, M., & Košir, I. J. (2019). The determination of the geographic origins of hops (Humulus lupulus L.) by multi-elemental fingerprinting. Food chemistry, 277, 32-37.
23. [23] Š Uštar‐Vozlič, J., & Javornik, B. (1999). Genetic relationships in cultivars of hop, Humulus lupulus L., determined by RAPD analysis. Plant breeding, 118(2), 175-181.
24. [24] Somalraju, A., Soto-Cerda, B., Ghose, K., McCallum, J., Knox, R., & Fofana, B. (2023). Structure and genetic diversity of Canadian Maritimes wild hops. Genome, 67(1), 24-30. http://dx.doi.org/10.1139/gen-2023-0045
25. [25] Tegopoulos, K., Fountas, D. V., Andronidou, E. M., Bagos, P. G., Kolovos, P., Skavdis, G., ... & Grigoriou, M. E. (2023). Assessing Genetic Diversity and Population Differentiation in Wild Hop (Humulus lupulus) from the Region of Central Greece via SNP-NGS Genotyping. Diversity, 15(12), 1171. https://doi.org/10.3390/d15121171