Development, optimization, and validation of a DNA barcoding–based multiplex PCR system for the molecular identification and taxonomic discrimination of Xanthium strumarium and Xanthium spinosum

Abstract

Purpose: Accurate species identification is essential for the assessment of plant diversity, taxonomic classification, and the reliable evaluation of plant-derived materials. Molecular approaches have become increasingly important when morphological identification is limited by interspecific similarity, environmental variation, or the loss of diagnostic characteristics. The genus Xanthium, which is widely distributed throughout the flora of Türkiye, represents a suitable model taxon for molecular and taxonomic investigations due to its spiny, easily transferable fruits and pronounced phenotypic plasticity influenced by environmental conditions. These characteristics often limit the reliability of morphological identification and highlight the need for molecular-based approaches. The present study aimed to develop and validate a DNA barcoding based molecular identification method supported by multiplex PCR for the molecular characterization of Xanthium strumarium and Xanthium spinosum, with potential application in forensic botanical examinations. Method: A total of 50 Xanthium samples were analyzed using an optimized multiplex PCR system targeting five barcode loci: D35, psbA–trnH, trnL–trnF, ITS-2, and trnQ–rps16. The amplified products were evaluated by capillary electrophoresis. The method was validated in terms of analytical threshold, dynamic range, sensitivity, full-profile recovery, reproducibility, and specificity. Findings: Capillary electrophoresis results revealed consistent and reproducible electrophoretic profiles among the analyzed samples, with allele size ranges spanning 66–218 bp. Method validation established an analytical threshold of 93.39 RFU, a dynamic range of 0.1–3 ng/µL, and a minimum DNA concentration of 0.5 ng/µL for full-profile recovery. Specificity testing demonstrated no amplification in the taxonomically distant species Salvia officinalis and Ephedra major. Conclusion: The findings indicate that the proposed DNA barcoding and multiplex PCR–based approach represents a reliable, sensitive, and applicable molecular tool for the characterization of Xanthium strumarium and Xanthium spinosum. The method may complement morphological assessment and contribute to molecular identification studies involving morphologically similar plant taxa, including plant-derived evidence encountered in forensic investigations.

Keywords

• DNA barcoding
• molecular identification
• multiplex PCR
• plant taxonomy
• Xanthium strumarium
• Xanthium spinosum

Supporting Institution

Üsküdar University Institute of Addiction and Forensic Sciences

Ethical Statement

This study does not require ethical approval.

Xanthium strumarium ve Xanthium spinosum’un moleküler tanımlanması ve taksonomik ayrımına yönelik DNA barkodlama temelli multipleks PCR sisteminin geliştirilmesi, optimizasyonu ve validasyonu

Abstract

Amaç: Doğru tür tanımlaması; bitki çeşitliliğinin değerlendirilmesi, taksonomik sınıflandırma ve bitki kökenli materyallerin güvenilir biçimde incelenmesi açısından temel öneme sahiptir. Morfolojik tanımlamanın türler arası benzerlik, çevresel değişkenlik veya ayırt edici özelliklerin kaybı nedeniyle sınırlı kaldığı durumlarda moleküler yaklaşımlar giderek daha fazla önem kazanmaktadır. Türkiye florasında yaygın olarak bulunan Xanthium cinsi; dikenli ve kolay taşınabilir meyveleri ile çevresel koşullardan etkilenen belirgin fenotipik plastisitesi nedeniyle moleküler ve taksonomik araştırmalar açısından uygun bir model taksondur. Bu özellikler, morfolojik tanımlamanın güvenilirliğini sıklıkla sınırlandırmakta ve moleküler temelli yaklaşımlara duyulan gereksinimi ortaya koymaktadır. Bu çalışmada, Xanthium strumarium ve Xanthium spinosum türlerinin moleküler karakterizasyonuna yönelik, adli botanik incelemelerde potansiyel uygulama alanı bulunan multipleks PCR destekli DNA barkodlama temelli bir moleküler tanımlama yönteminin geliştirilmesi ve valide edilmesi amaçlanmıştır. Metod: Toplam 50 Xanthium örneği, beş barkod lokusunu hedefleyen optimize edilmiş bir multipleks PCR sistemi kullanılarak analiz edilmiştir. Hedeflenen lokuslar D35, psbA–trnH, trnL–trnF, ITS-2 ve trnQ–rps16’dır. Amplifikasyon ürünleri kapiller elektroforez ile değerlendirilmiştir. Yöntem; analitik eşik, dinamik aralık, duyarlılık, tam profil elde edilmesi, tekrarlanabilirlik ve özgüllük açısından valide edilmiştir. Bulgular: Kapiller elektroforez sonuçları, incelenen örnekler arasında tutarlı ve tekrarlanabilir elektroforetik profiller elde edildiğini ve alel büyüklük aralıklarının 66–218 bp arasında değiştiğini göstermiştir. Yöntem validasyonu sonucunda analitik eşik 93,39 RFU, dinamik aralık 0,1–3 ng/µL ve tam profil elde edilmesi için gerekli minimum DNA konsantrasyonu 0,5 ng/µL olarak belirlenmiştir. Özgüllük testlerinde, taksonomik olarak uzak türler olan Salvia officinalis ve Ephedra major örneklerinde amplifikasyon gözlenmemiştir. Sonuç: Bulgular, önerilen DNA barkodlama ve multipleks PCR temelli yaklaşımın Xanthium strumarium ve Xanthium spinosum türlerinin karakterizasyonu için güvenilir, duyarlı ve uygulanabilir bir moleküler araç olduğunu göstermektedir. Bu yöntem, morfolojik değerlendirmeyi tamamlayabilir ve adli incelemelerde karşılaşılan bitki kökenli deliller de dahil olmak üzere morfolojik olarak benzer bitki taksonlarını konu alan moleküler tanımlama çalışmalarına katkı sağlayabilir.

Keywords

• DNA barkodlama
• moleküler tanımlama
• multipleks PCR
• bitki taksonomisi
• Xanthium strumarium
• Xanthium spinosum

Supporting Institution

Üsküdar Üniversitesi Bağımlılık ve Adli Bilimler Enstitüsü

Ethical Statement

Bu çalışma için etik kurul onayı gerekmemektedir.

References

1. [1] Elkins, K. M. (2013). Forensic DNA biology: A laboratory manual. Elsevier.
2. [2] Malmström, B. G. (Ed.). (1997). Nobel lectures: Chemistry 1991–1995. World Scientific.
3. [3] Budowle, B., Schutzer, S. E., Einseln, A., Kelley, L. C., Walsh, A. C., Smith, J. A. L., … Campos, J. (2003). Building microbial forensics as a response to bioterrorism. Science, 301(5641), 1852–1853. doi:10.1126/science.1090083
4. [4] Chen, S., Yao, H., Han, J., Liu, C., Song, J., Shi, L., … Leon, C. (2010). Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLOS ONE, 5(1), Article e8613. doi:10.1371/journal.pone.0008613
5. [5] Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., & Janzen, D. H. (2005). Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(23), 8369–8374. doi:10.1073/pnas.0503123102
6. [6] Chase, M. W., Cowan, R. S., Hollingsworth, P. M., van den Berg, C., Madriñán, S., Petersen, G., … Wilkinson, M. (2007). A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants. Taxon, 56(2), 295–299. doi:10.1002/tax.562004
7. [7] Hollingsworth, P. M., Graham, S. W., & Little, D. P. (2011). Choosing and using a plant DNA barcode. PLOS ONE, 6(5), Article e19254. doi:10.1371/journal.pone.0019254
8. [8] Aquila, I., Ausania, F., Di Nunzio, C., Serra, A., Boca, S., Capelli, A. M., … Ricci, P. A. (2014). The role of forensic botany in crime scene investigation: Case report and review of literature. Journal of Forensic Sciences, 59(3), 820–824. doi:10.1111/1556-4029.12401

9. [9] Ünsal Sapan, T., Acarkan, E., & Sandıkçı, N. (2025). Determination of efficient DNA recovery method in Pyracantha coccinea for use in forensic botany. Anatolian Journal of Botany, 9(1), 6–10. doi:10.30616/ajb.15406
10. [10] Intron Biotechnology, Inc. (2012). i-genomic plant DNA extraction mini kit: Instruction manual for genomic DNA extraction from plant tissues using silica membrane (2nd ed.).
11. [11] Invitrogen. (2021). Qubit dsDNA HS assay kits: User guide. Thermo Fisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kit User Guide (Pub. No. MAN0002326 C.0).
12. [12] National Center for Biotechnology Information. (2025). National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine. https://www.ncbi.nlm.nih.gov
13. [13] QIAGEN. (2016). QIAGEN multiplex PCR handbook. https://www.qiagen.com/us/resources/kithandbook/en-qiagen-multiplex-pcr-handbook
14. [14] Özyer, S., Uslu, Z. S., Ünsal Sapan, T., Bülbül, Ö., & Filoğlu, G. (2023). The development of the novel 22 X-indel multiplex system for forensic genetics. Legal Medicine, 62, Article 102224. doi:10.1016/j.legalmed.2023.102224
15. [15] Scientific Working Group on DNA Analysis Methods. (2015). Validation guidelines for DNA analysis methods. https://www.swgdam.org/_files/ugd/4344b0_813b241e8944497e99b9c45b163b76bd.pdf
16. [16] Auld, B. A., McRae, C. F., & Say, M. M. (1988). Possible control of Xanthium spinosum by a fungus. Agriculture, Ecosystems & Environment, 21(3–4), 219–223. doi:10.1016/0167-8809(88)90089-8
17. [17] Kim, Y. S., Kim, J. S., Park, S.-H., Choi, S.-U., Lee, C. O., Kim, S.-K., … Ryu, S. Y. (2003). Two cytotoxic sesquiterpene lactones from the leaves of Xanthium strumarium and their in vitro inhibitory activity on farnesyltransferase. Planta Medica, 69(4), 375–377. doi:10.1055/s-2003-38879
18. [18] Laurence, A. R. (2018). Forensic palynology in the United States: The search for geolocation. Microscopy and Microanalysis, 24(S1), 1186–1187. doi:10.1017/S1431927618006414
19. [19] Mildenhall, D. C. (2006). Hypericum pollen determines the presence of burglars at the scene of a crime: An example of forensic palynology. Forensic Science International, 163(3), 231–235. doi:10.1016/j.forsciint.2005.11.028
20. [20] Gilmore, S., Peakall, R., Robertson, J., & Short, J. (2003). Short tandem repeat DNA markers are hypervariable and informative in Cannabis sativa: Implications for forensic investigations. Forensic Science International, 131(1), 65–74. doi:10.1016/S0379-0738(02)00397-3
21. [21] Schield, C., Campelli, C., Sycalik, J., Randle, C., Hughes-Stamm, S., & Gangitano, D. (2016). Identification and persistence of Pinus pollen DNA on cotton fabrics: A forensic application. Science & Justice, 56(1), 29–34. doi:10.1016/j.scijus.2015.11.005
22. [22] Mackenzie, G., Boa, A. N., Diego-Taboada, A., Atkin, S. L., & Sathyapalan, T. (2015). Sporopollenin: The least known yet toughest natural biopolymer. Frontiers in Materials, 2, Article 66. doi:10.3389/fmats.2015.00066
23. [23] Dokane, K. (2024). Analysis of markers for forensic plant species identification. Forensic Science International, 358, 112007. https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2024.112007
24. [24] Liu, Z.-F., Ma, H., Zhang, X.-Y., et al. (2022). Do taxon-specific DNA barcodes improve species discrimination relative to universal barcodes in Lauraceae? Botanical Journal of the Linnean Society, 199(4), 741–753.
25. [25] Yu et al. (2022). Species discrimination in Schima (Theaceae): Next-generation super-barcodes meet evolutionary complexity. Molecular Ecology Resources. DOI: 10.1111/1755-0998.13683