Detection and Molecular Characterization of Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) in Spinach Production Fields of Çanakkale Province, Turkey

Abstract

Spinach is an important winter vegetable and it is produced in all regions in Turkey. There are many diseases affecting the yield and quality in its production. Viruses have an important role among them. One of these virus diseases is Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV), called Rhizomania disease. The presence of BNYVV in the spinach plant was determined by serological methods in Turkey, but no studies were conducted at the molecular level. For this purpose, field studies were carried out in 2017-2018 in order to determine the presence of BNYVV in the fields of spinach cultivation at the level of Çanakkale province and its districts. In these field studies, 66 samples were collected from spinach plants showing typical virus symptoms. The presence of BNYVV in the samples was determined by DAS-ELISA test, a method based on virus protein. According to the DAS-ELISA test, 12 out of 66 samples were infected with BNYVV. One of the infected samples was selected (CNKSpinach39) and the coat protein gene (CP) was amplified by RT-PCR. Its RT-PCR product was purified and sequenced. The amino acid (aa) sequences of this isolate was deduced based on its nt sequence. These nt and aa sequences were compared with the related sequences of the world BNYVV isolates and their similarities and phylogenetic relationships were determined. As a result of multiple sequence comparisons based on nt and aa, it was determined that CNKSpinach39 isolates showed similarities with 95-99% of the world isolates. As a result of the phylogenetic analysis, it was determined that the isolate CNKSpinach39 was found in the B pathotype. In this study, the first BNYVV B pathotype was found in spinach in our country. 

Keywords

• PCR,similarity,phylogenetic,spinach,BNYVV

Çanakkale İli Ispanak Üretim Alanlarında Pancar Nekrotik Sarı Damar Virüsü (Beet Necrotic Yellow Vein Virus; BNYVV)’nün Tespiti ve Moleküler Karakterizasyonu

Abstract

Ispanak önemli bir kışlık sebze olup ülkemizin her bölgesinde üretimi yapılmaktadır. Ispanak üretiminde verim ve kaliteyi etkileyen birçok hastalık etmeni vardır ve bunlar içerisinden virüsler önemli bir yer tutmaktadır. Bu virüs hastalıklarından bir tanesi “Rhizomonia” olarak ta adlandırılan Pancar nekrotik sarı damar virüsü (Beet necrotic yellow vein virus; BNYVV)’dür. BNYVV’nin ülkemizde ıspanak bitkisinde varlığı serolojik yöntemlerle belirlenmiş ancak moleküler düzeyde bir çalışma yapılmamıştır. Bu amaçla Çanakkale’de il ve ilçe düzeyinde ıspanak yetiştiriciliği yapılan alanlara BNYVV’nin varlığını belirlemek ve tanısını yapmak amacı ile 2017-2018 üretim yılında bir arazi çalışması gerçekleştirilmiştir. Bu arazi çalışması kapsamında tipik virüs simptomları gösteren ıspanak bitkilerinden 66 örnek alınmıştır. Alınan örneklerdeki BNYVV varlığı virüs proteinine dayalı bir yöntem olan DAS-ELISA testi ile belirlenmiştir. DAS-ELISA testi sonuçlarına göre 66 örneğin 12’si BNYVV ile enfekteli bulunmuştur. Enfekteli bulunan örnekler içerisinden bir tanesi seçilerek (CNKSpinach39) örtü protein geni (coat protein; CP) RT-PCR ile çoğaltılmıştır. CP geni çoğaltılan izolatın RT-PCR ürünleri saflaştırılmış ve nükleotid dizileri belirlenmiştir. Elde edilen nükleotit (nt) dizileri kullanılarak seçilen izolata ait CP geninin amino asit (aa) dizileri çıkarılmıştır. Bu nükleotid ve amino asit dizileri dünya BNYVV izolatlarının CP genlerinin nükleotid ve amino asit dizileri ile karşılaştırılarak, göstermiş oldukları benzerlik oranları ve filogenetik ilişkileri saptanmıştır. Gerçekleştirilen çoklu nt ve aa temelli dizi karşılaştırmaları sonucunda CNKSpinach39 izolatının dünya izolatları ile %95-99 oranında benzerlikler gösterdiği belirlenmiştir. Gerçekleştirilen filogenetik analizler sonucunda ise CNKSpinach39 izolatının B patotipinde yer aldığı tespit edilmiştir. Bu çalışma ile ülkemizde ıspanakta ilk defa BNYVV’nin B patotipi bulunmuştur. 

Keywords

• PCR,benzerlik,filogenetik,ıspanak,BNYVV

References

1. Abe H., Tamada T., 1986. Association of Beet Necrotic Yellow Vein Virus with Isolates of Polymyxa Betae Keskin. Annls. Phytopath. Soc. Jap., 52: 235-247.
2. Ahmad S., Ali A., Ahmad M., Ullah N., Afridi U.K., Bostan N., Qureshi R., Tawwab S., Ahmad I., Zubair M.i 2018. Characterization of beet necrotic yellow vein virus in Pakistan. Journal of Plant Pathology, 100 (2): 357-357.
3. Borodynko N., Rymelska N., Hasiów-Jaroszewska B., Pospieszny H., 2009. Molecular characterization of three soil-borne sugar beet-infecting viruses based on the coat protein gene. Journal of Plant Pathology, 191-193.
4. Chiba S., Kondo H., Miyanishi M., Andika I.B., Han C., Tamada T., 2011. The evolutionary history of beet necrotic yellow vein virus deduced from genetic variation, geographical origin and spread, and the breaking of host resistance. Mol. Plant Microbe Interact., 24, 207-218.
5. Clark M. F., Adams A. N. 1977. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology, 34 (3): 475-483.
6. Erbay E., 2012. Gediz Havzası Ispanak Üretim Alanlarında Görülen Virüs Hastalıklarının Belirlenmesi Üzerine Araştırmalar. Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Ens., Yüksek Lisans Tezi.
7. Gökdağ S., Karanfil A., Korkmaz S., 2016. Çanakkale ili ıspanak alanlarındaki şalgam mozaik virüsü ve hıyar mozaik virüsü varlığının belirlenmesi. BAHÇE Özel sayı: VII. Ulusal Bahçe Bitkileri Kongresi Bildirileri-Cilt II: Sebzecilik-Bağcılık-Süs Bitkileri, 166-170.
8. Güngör M., Uzunbacak H., Kutluk Yılmaz N.D., Şevik M.A., 2017. Samsun ili ıspanak üretim alanlarında enfeksiyon oluşturan virüslerin belirlenmesi. Anadolu Tarım Bilim. Derg./Anadolu J Agr Sci, 32, 164-168.

9. Harju V.A., Mumford R.A., Blockley A., Boonham N., Clovert G.R.G., Weekes R., Henry C.M., 2002. Occurrence in the United Kingdom of Beet necrotic yellow vein virus isolates which contain RNA 5. Plant Pathol., 51: 811.
10. Karanfil A., Gökdağ S., Korkmaz S., 2016. Çanakkale ili ve ilçeleri ıspanak üretim alanlarındaki Pancar nekrotik sarı damar virüsü (Beet necrotic yellow vein virus; BNYVV) enfeksiyonunun araştırılması. Uluslararası Katılımlı Türkiye VI. Bitki Koruma Kongresi, 592, 5-8 Eylül, Konya.
11. Koenig R., Lennefors B.L., 2000. Molecular analyses of European A, B and P Type Sources of Beet Necrotic Yellow Vein Virus and Detection of The Rare P Type in Kazakhstan. Arch Virol., 145: 1561–1570.
12. Koenig R., Lüdecke P., Haeberle A.M., 1997. Detection and Characterization of a Distinct Type of Beet Necrotic Yellow Vein Virus RNA 5 in a Sugar Beet Growing Area in Europe. Arc Virol., 142: 1499-1504.
13. Kruse M., Koenig R., Hoffman A., Kaufmann A., Commandeur U., Solevyev A.G., Savenkov I., Burgermeister W., 1994. Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of Reverse Transcription-PCR Products Reveals the Existence of Two Major Strain Groups of Beet Necrotic Yellow Vein Virus. J Gen Virol., 75:1835–1842.
14. Kumar S., Stecher G., Tamura K., (2016). MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution, 33, 1870-1874.
15. Kutluk-Yılmaz N.D., Arli-Sokmen M., Kaya R., Sevik M.A., Tunali B., Demirtas S., 2016a. The widespread occurrences of Beet soil borne virus and RNA-5 containing Beet necrotic yellow vein virus isolates in sugar beet production areas in Turkey. Eur J Plant Pathol. 144(2):443–455.
16. Kutluk-Yılmaz N.D., Kaya-Altop E., Phillippo C.J., Mennan H., 2016b. New Natural Weed Host Raphanus raphanistrum L. (Brassicaceae) for Beet Necrotic Yellow Vein Virus and Its Vector Polymyxa betae Keskin. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 40, 120-126.
17. Lennefors B.L., 2006. Molecular Breeding for Resistance to Rhizomania in Sugar Beets. Swedish University of Agricultural Sciences, 2006. Doctoral Thesis, 41pp. Uppsala.
18. Lennefors B.L., Savenkov E.I., Mukasa S.B., Valkonen J.P.T., 2005. Sequence Divergence of Four Soilborne Sugarbeet-Infecting Viruses. Virus Genes, 31 (1), 57–64.
19. Li R., Mock R., Huang Q., Abad J., 2008b. Hartung, J.; Kinard, G. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods, 154 (1-2): 48–55.
20. Li M., Liu T., Wang B., Han C., Li D., Yu J., 2008a. Phylogenetic analysis of Beet necrotic yellow vein virus isolates from China. Virus Genes, 36 (2), 429-432.
21. Meunier A., Schmit J.F., Bragard C., 2005. Comparison of the beet necrotic yellow vein virus P75 nucleotide sequences of Belgian type A and type B sources. Virus Res., 108 (1-2),15-22.
22. Miyanishi M., Kusume T., Saito M., Tamada T., 1999. Evidence for three groups of sequence variants of beet necrotic yellow vein virus RNA 5. Arch Virol., 144 (5), 879-892.
23. Muhire B.M., Varsani A., Martin D.P., 2014. SDT: A virus classification tool based on pairwise sequence alignment and identity calculation. PLoS One, 9 (9), 1-8.
24. Özgör O.E., 1995. Türkiye Şeker Pancarı Hastalıkları. Türkiye Şeker Fabrikaları A.Ş. Genel Müdürlüğü, 218: 33-47.
25. Putz C., Merdinoğlu O., Lemaire O., Stocky G., Valentin P., Wiedemann S., 1990. Beet Necrotic Yellow Vein Virus, Causal Agent of Sugar Beet Rhizomania. Rew .Pl. Path., 69 (5): 247-254.
26. Rush C.M., Heidel G.B., 1995. Furovirus Diseases of Sugar Beets in the United States. Plant Dis, 79 (9) : 868-875.
27. Schirmer A., Link D., Cognat V., Moury B., Beuve M., Meunier A., Bragard C., Gilmer D., Lemaire O., 2005. Phylogenetic analysis of isolates of Beet necrotic yellow vein virus collected worldwide. Journal of General Virology, 86, 2897–2911.
28. Tamada T., Abe H., Saito M., Kiguchi T., Harada T., 1989. Production and pathogenicity of isolates of Beet necrotic yellow vein virus with different numbers of RNA components. J Gen Virol. 70:3399–3409.
29. Tamada T., Baba T., 1973, Beet Necrotic Yellow Vein Virus from "Rhizomania" Affected Sugar Beet in Japan. Annls. Phytopath. Soc. Japan, 39:325-352.
30. Whitney E.D., Duffus J.E., 1991. Rhizomania (Beet Necrotic Yellow Vein Virus). Compendium of Beet Diseases and Insects, APS Pres, 76p, USA.
31. Yılmaz N.D., Erkan S., 2003. Şeker Pancarı'nda Rhizomania Hastalığı. OMÜ Ziraat Fakültesi Dergisi, 20 (1): 64-72.
32. Zhuo N., Jiang N., Zhang C., Zhang Z.Y., Zhang G.Z., Han C.G., Wang Y., 2015. Genetic diversity and population structure of beet necrotic yellow vein virus in China. Virus Res., 205, 54-62.