EMBRİYO KÜLTÜRÜ TEKNİĞİ

Abstract

Akşam saat 5’de Wistar türü dişi ve erkek sıçanlar aynı kafeste tutulur. Ertesi gün dişi sıçanlardan vaginal smear alınarak sperm olup olmadığına bakılır. Vajinal smearde sperm görülen dişiler 0.5 günlük hamile olarak kabul edilir ve ayrı kafese alınarak 9 gün bekletilir. 9.5 günlük hamile dişi sıçanlara eter anestezisi uygulanarak düz bir satıh üzerine sırt üstü yatırılır ve hayvanın karnında V şeklinde kesi yapılarak deri yukarı doğru katlanır. Aortun çatallanma yerinden bir enjektörle girilerek alınabildiği kadar kan alınır. Kan alınır alınmaz 3500 rpm’de 5 dakika santrifüj edilir ve serum elde edilmek üzere saklanır. Uterus boynuzunda bulunan embriyolar Hanks solusyonu içeren steril petri kabına konur. Bu aşamadan sonraki tüm işlemler Laminar-air flow kabinde ve steromikroskop altında gerçekleştirilir. Uterus kası antimezometrial kenar boyunca kesilir. Desidual doku ve sonra da embriyonun Reicherts membranı çıkartılır Embriyo medium içeren petri kabına konur. Sağlam embriyolar beşerli gruplara ayrılır ve içerisinde 5ml sıçan serumu bulunan 50 ml’lik cam kültür şişelerine konur. Embriyo bulunan şişelere O2, CO2, ve N2 gaz karışımı 1dk süreyle verilir. Kültür şişeleri dakikada yaklaşık 30 devirle (30rpm/dk) dönen 37°C’ lik roller inkübatöre periyodundan sonra 11,5 günlük embriyoların gelişimi 17 embriyonik tomurcuğun gelişimini içeren Morfolojik Skorlama Sistemine göre morfolojik olarak değerlendirilir

Keywords

• Embriyo kültürü, morfolojik skorlama, sıçan

The Embryo Culture Techniques

Abstract

Female Wistar rats were paired with their male partners in cages. The females were checked for presence of vaginal plugs as an indication of mating and hence fertilisation. On the assumption that mating occurred around midnight, the female was considered to be 0.5-day pregnant at noon that day. The pregnant females were kept in larger cages in groups at the same stage of pregnancy until use. At 9.5 days of gestation, the embryos were removed from the mother. The pregnant rat was anaesthetised with diethyl ether. Then, the animals were placed in a supine position. The abdomen opened by midline incision in the anterior wall. The uterine horns containing the conceptuses were excised and placed in Hank’s balanced salt solution. After this stage, the procedure was carried out in a laminar-air flow cabinet. Under a dissecting microscope, the decidual tissue around the conceptus was dissected and the parietal yolk sac and Reichert’s membrane were removed. Embryos were transferred to 50 cc glass culture bottle that include heat-inactivated heterologous rat serum. They were gassed with a mixture of O2,CO2,N2for one minute. The bottle was sealed with a sterile silicon bung and placed in a roller incubator rotating at approximately 30 rpm at 37°C. After 48 hours culture period, which is equivalent of 11.5 days, the embryos were harvested and morphologically and biochemically.embryonic growth was estimated

Keywords

• Embryo culture, morphologic scoring, rat

References

1. Ulger, H & Pratten, M K. The effect of VEGF on embryonic development and yolk sac vas- cularisation. J. Anat. 1996, 189 (1): 239.
2. Ulger, H, Karabulut, A K & Pratten, M K. The effect of fibroblast growth factor on embryo- nic development and yolk sac vascularisation. Teratology 1996, 53: 32A
3. Ulger H, The Growth Promoting Effects Of bFGF, VEGF and PD-ECGF On Embryonic Development and Yolk Sac Vascularisation, PhD Thesis, Department of Human Anatomy and Cell Biology University of Nottingham, England 1997.
4. Van Maele-Fabry, G Delhaise F and Picard J J. Morphogenesis and quantification of the development of post-implantation mouse embr- yos in vitro. Toxicol 1990, 4:149-156.
5. Mcbride WG. Thalidomide and congenital abnormalities. Lancet 1961, 16:1358
6. Kohhar D M. In vitro testing of teratogenic agents using mammalian embryos. Teratog Carcinog Mutagen 1980, 1:63-74.