Şanlıurfa’da Satışa Sunulan Yoğurtlarda Lactobacillus spp.’lerin qPCR Miktarlarının Belirlenmesi

Yıl 2016, Cilt: 27 Sayı: 2, 82 - 87, 15.12.2016

Akın Yiğin Mehmet Demirci Serap Kılıç Altun Atila Yoldaş

https://doi.org/10.35864/evmd.514487

Öz

Yoğurt; geleneksel süt fermentasyonunda büyük bir rol oynayan ve probiyotik etkinlikleri olan bakterileri içermesi nedeniyle hayatımıza sağlık katan en önemli besin maddelerinden biridir. Günümüzde oldukça fazla tüketilen probiyotiklerin; yoğurtlardaki miktarlarının artması veya azalması ve mikrobiyolojik kalitelerinin tespiti halk sağlığı açısından irdelenmesi gerekmektedir. Bu çalışmada, Şanlıurfa ili ve çevre ilçelerinde satışa sunulan yoğurtlarda; probiyotik olarak önemi sıkça bildirilen Lactobacillus spp.’lerin (LAB) qPCR metodu ile tanımlanarak, kantitatif olarak miktar analizinin yapılması amaçlanmıştır. Yoğurt örneklerinden direk izolasyon ile elde edilen DNA’lardan Lactobacillus spp.’nin qPCR ile tespiti için; Lactobacillus spp. 16S-23S ribosomal RNA Intergenic Spacer Region (ISR) gen bölgesine spesifik primerler kullanılmıştır. Real-time PCR ile yapılan analizler sonucunda, 14 ile 32 aralığında Ct saptanmıştır ve kantitatif analizin hassasiyetini korumak için, miktarları belli plazmid standart kullanarak 102 ile 108 CFU/g arasında standart eğri elde edildi ve real-time PCR analizlerinde kantitasyon bu eğri ile gerçekleştirilmiştir. Bu sayede alt limit olarak 102 CFU/g gibi hassas bir alt limit belirlenmiştir. Sonuçlar, Lactobacillus spp. insan sağlığı açısından değerli, probiyotik bakterilerin, bölgemizde satışa sunulan ev yapımı yoğurtlarda daha düşük düzeyde bulunduğunu, bölgemizdeki bu yoğurtların, tüketime olgunlaşma süreci tamamlanmadan sunuluyor olabileceğini, bu ürünlerin üretim sürecinde dikkat edilmesi gerektiği tespit edilmiştir. Ayrıca sonuçlar, ülkemizde ilk kez klasik mikrobiyolojik yöntemler yerine, real-time PCR yönteminin insan sağlığı açısından probiyotik önemleri olan Lactobacillus spp.’lerin miktar analizlerinde hızlı, hassas ve güvenilir olarak tespiti için kullanılabilecek bir yöntem olduğunu göstermiştir.

Anahtar Kelimeler

Kantitasyon, Lactobacillus spp., real-time PCR, yoğurt

Kaynakça

• 1. Coeuret V, Dubernet S, Bernardeau, M, Gueguen M, Vernoux J.P, (2003). Isolation, characterisation and identification of lactobacilli focusing mainly on cheeses and other dairy products. Le Lait, INRA Editions. 83, 269-306.
• 2. Demirkaya AK, Gökalp Z (2013). Bilecik’te Tüketime Sunulan Yoğurtların Kimyasal ve Mikrobiyolojik Kalitesinin Araştırılması. Atatürk Ünv Vet. Bil. Derg. 8(3), 202-209.
• 3. EC (2007) Corrigendum to Regulation (EC) No 1924/2006 of the European Parliament and of the Council of 20 December 2006 on nutrition and health claims made on foods (Official Journal of the European Union L 404 of 30 December 2006). Off J Eur Union L12, 3-18.
• 4. Erdoğrul Ö, Erbilir F, (2006). Isolation and Characterization of Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus casei from Various Foods. Turk J Biol. 30, 39-44.
• 5 Ertaş N, Serhat A, Karadal F, Gönülalan Z, (2014). Kayseri İlinde Satışa Sunulan Manda Yoğurtlarının Mikrobiyolojik Kalitesi. İstanbul Ünv Vet Fak Derg. 40 (1), 83-89.
• 6. Furet JP, Quennee P, Tailliez PP, (2004). Molecular quantification of lactic acid bacteria in fermented milk products using real-time quantitative PCR. Int J Food Microbiol. 97, 197-207.
• 7. Galanis A, Kourkoutas Y, Tassou CC, Chorianopoulos N, (2015). Detection and Identification of Probiotic Lactobacillus plantarum Strains by Multiplex PCR Using RAPD-Derived Primers. Int J Mol Sci. 16(10), 25141-53.
• 8. García-Albiach R, María J, Pozuelo D, Santiago A, María-Isabel M, Daniel B, Fernando B, Rosa C, (2008). Molecular analysis of yoğurt containing Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus in human intestinal microbiota. Am J Clin Nutr 87-91-6.
• 9. Gianluca B, Lucia R, Franco D, Sandra T, (2003). Development of Reverse Transcription (RT)-PCR and Real-TimeRT-PCR Assays for Rapid Detection and Quantification of Viable Yeasts and Molds Contaminating Yogurts and Pasteurized Food Products. Appl Environ Microbiol. Jul;69(7):4116-22.
• 10. Herbel SR, Lauzat B, Von Nickisch-Rosenegk M, Kuhn M, Murugaiyan J, Wieler LH, Guenther S, (2013). Species-specific quantification of probiotic lactobacilli in yoghurt by quantitative real-time PCR. J Appl Microbiol. 115, (6) 1402-1410.
• 11. Kandler O, Weiss N, (1984). Genus Lactobacillus, in: Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt JG, (Eds.), Bergey’s Manual of Systematics Bacteriology, Williams and Wilkins, Baltimore M.D., USA, pp. 1209-1234.
• 12. Keleş F, (2003). Konya yöresi taze ev yapımı yoğurtların mikrobiyolojik özelliklerinin araştırılması. Yüksek Lisans Tezi, SÜ Fen Bilimleri Enstitüsü, Konya.
• 13. Kwon HS, Yang EH, Yeon SW, Kang BH, Kim TY, (2004). Rapid identification of probiotic Lactobacillus species by multiplex PCR using species-specific primers based on the region extending from 16S rRNA through 23S rRNA. FEMS Microbiol Lett, 239, 267-275.
• 14. Maier S, Olek A, (2002). Diabetes: a candidate disease for efficient DNA methylation profiling. J Nutr 132, 2440-2443.
• 15. Margolles A, Mayo B, Ruas-Madiedo P, (2009). Screening, identification, and characterization of Lactobacillus and Bifidobacterium strains. In Handbook of probiotics and prebiotics ed. Nomoto, K., Salminen, S. and Lee, Y.K. p. 15. Hoboken, NJ: John, Wiley & Sons, Inc.
• 16. Rinttilä T, Kassinen A, Malinen E, Krogius L, Palva A, (2004). Development of an extensive set of 16S rDNA-targeted primers for quantification of pathogenic and indigenous bacteria in faecal samples by real-time PCR. J Appl Microbiol. 97(6), 1166-77.
• 17. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Press, New York.
• 18. Udo F, Jan L, (2006). Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry- Fluorescence In Situ Hybridization. Appl Environ Microbiol., 72(6), 4163-4171
• 19. Sömer VS, (2010). Dayanıklı Yoğurtların Mikrobiyolojik Fizikokimyasal Özelliklerinin ve Biyojen amin içeriklerinin belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, MAE Ünv. Fen bilimleri Enstitüsü, Burdur.
• 20. Zamfir M, Vancanneyt M, Makras L, Vaningelgem F, Lefebvre K, Pot B, Swings J, De Vuyst L, (2006). Biodiversity of lactic acid bacteria in Romanian dairy products. Syst Appl Microbiol, 29(6):487-95.
• 21. Zhang ZG, Ye ZQ, Yu L, Shi P, (2011). Phylogenomic reconstruction of lactic acid bacteria: an update. BMC Evol B