Studıes On Bhk-21 Cell Culture For The Large Scale Productıon Of Foot-And-Mouth Dısease Vırus

Yıl 1969, Cilt: 3 Sayı: 7-8, 55 - 68, 01.12.1969

Güngör Okay H.c. Girard M. Sütçü M. Şentürk Macit Oral Cemil Boz Orhan Bayramoğlu Nejdet Yalım Necati Ünlüleblebici İlhan Süer Cumhuriye Anter

Öz

BHK- 21 cell was first grown in manolayer stationary cultures
using Hanks' BSS cont8ining 10% bovine serum, 0.01 % yeast
extract, and ·0.5% lactalbumin hydrolysate (HYL).
These cells did not grow in Hanks' lactalbuınin medium without
yeast extract. So yeast extract must be considered as an
essential part for BHK cell development in Hanks' lactalbumin
medium.
BHK- 21 cell adapted to manolayer culture was then serially
passed in Bellco apparatus and in New Brunswick fermentors to
adapt to suspension culture.
HYL medium was supported with 1 % tryptose phosphate
1Jroth added at the 24 th hour of culture.
The pH of the suspension, in New Brunswick fermentors,
was adjusted with sterile air on the surface, after 24 hour of incubation,
at the ratio of 300 cc/minute.
When the initial cell count was 1.0 to 1.2 X 10'/ml, the cells
increased only 2- 3 times, but when the initial cell number was
only 5.0 X HY1 /ml the increase was an average of 5 times. In the first case, when initial cells were more concentrated, the pH was
difficult to regulate at the second day of incubation, whereas, in
the later case with the addition of air on the surface, the pH between
7.2-7.4 was easier.
The cell suspension was harvested at the 48 th hour of ineuhation
and left overnight at + 4 ·c for sedimentation.
To carry out the rolling flask manolayer cell culture, the supernatant
of suspended cell culture was decanted, and the cells
were diluted to 50.000/ml in HYL medium containing ıo %' bovine
serum, then ıso ml put into each ı litre capacity rolling flask and
placed in the incubator. The confluency ·of the cells was almost
100% on the 3 rd day. For virus culture, the growth medium is
removed and replaced with 100 ml of HY~, without serum, containing
virus (either calf kidney virus or virus adapted With 5-6
passages to BHK cells) in amount of o.ı TCDso/cell.
, The virus was harvested at the 30 th hours of infection. At
this time, there was a nearly complete lysis of cellular monolayer.
This vaccine virus was then treated with ı % chloroform and
kept overnight at + 4 ·c; the next morning it was centrifuged at
10,000 rpm in a Westfalia separator, the same treatment was repeated
with 0.6% chloroform. The virus was then filtered through
Seitz K- 5 clarifying filter pad.
Infectivity titer of the virus was carried out on the BHK cell
c.ultures grown in tubes according to the CPE of the ·virus, antigenicity
before (AT) and after areton 113 treatment (ATAT) were
determined by semi- quantitative complement- fixation test.
S ml cattle dose of vaccine contained 2 ml of virus.
The vaccines were formalin inactivated at 26 ·c ·for 48 hours
and contained saponin as adjuvant.
The infectivity· and antigenic titers of vaccine viruses and the
results of vaccine challenges were very satisfactory as shown in
(Table : 1)

Büyük Mikyasta Şap Virusu İstihsalinde BHK-21 (Yavru Hamster Böbreği) Hücre Kültürünün Kullanılması Üzerinde Çalışmalar

Öz

BHK- 21 Hücre Dizisi % O.S Lactalbumin hydrolysate, % 0.01
Yeast extr-act ve % 10 Sığır serumu .ihtiva eden Hanks' Dengeli
Tuz Soh.ısyonu (HYL) içinde önce manolayer sabit hücre kültürlerinde
tiretilmiştir.
Vasattan Yeast extract ' çıkarıldığında BHK- 21 · hücresini üretmek
mümkün olamamış ve BHK hücresinin HYL ı vasatında üretilmesinde
Yeast extract ilavesinin şart olduğu anlaşılmıştır.
Manolayer üremeye adapte olmuş hücre Bellco cihazı ve New
Brunswick fermentörleri~1de seri pasajlar yapı~arak . suspansiyon
kültürüne adapte edilmiştir. Susparisiyon hücre kültürü çalışmalaı
·ında, üremenin 24. cü saatinde vasat % 1 Tryptose Phosphate
Broth ile takviye edilmiştir.
New Brunswick fermentörlernide pH . ayarlaması 24. cü saatten
itilxiren 300 cc/ dakika superfisiyal steril· hava verilerek yapılmıştır.
Suspansiyon ~ültürü çalışmalarında başlangıç hücre sayısı
1.0- 1.2 X lOS /ml olduğu haller de, 48 saate, 2- 3 misli çoğalma elde
eelilmesine rağmen, 5.0 X 104 hücre/ml ile başlandığında ortalama
5 misli üreme elde edilmiştir. Başlangıç hücre· sayısının fazla olduğu
birinci durumda 24. cü saatten itibaren pH kontrolü ele güçleşmiştir.
Halbuki, 5.0 x 104 hücre/ml ile başlandığında superfisiyal
hava vermekle pH .7.2 -7.4 arasında tutulabill!lektedir.
Rolling sistemde kültür hazırla,nabilmesi için enkubasyonun
48. ci saatinde toplanan hÜcre suspansiyonu bir gece + 4 oc de bekletilerek
hücreler dibe çöktürülmüş, ertesi günü, üstteki mayi
aıılarak, dibe çöken hücreler % 10 sığır -serumlu HYL vasatında
W.OOO hücre/ ml olacak şekilde sulandırılmış, 1 litre kapasiteli yuvarlak
şişelere 150 ml tevzi edilerek rolling sistem etüvüne koyulmuştur.
Hücrenin üreyip şişe sathını tamamen kaplaması 3 gün içinde
olmaktadır. Bunu takiben şişelerdeki vasat boşaltılmış ve 0.1
TCDso virus/hücre olacak şekilde (Dana böbreğii1e veya BHK hücresine
5-6 pasajcia adapte olmuş virus) virus ilave edilen HYL
vasatından herbir şişeye 100 ml konularak enfeksiyonun 30. cu
saatinde toplanmıştır. Bu anda hücreler şişe satlımdan tamamen
kalkmış bulunmaktadır.
Aşı istihsalinde kullanılacak bu virus önce % ı nisbetinde chloroform'la
karıştınlıp bir gece + 4 oc de bekletilerek, ertesi gün,
10.000 rpm de santrifüj edilmiş; aynı işlem ikinci defa % 0.6 nisbetinde
chloroform'la tekrarlanmıştır. Aşı hazırlanmadan evvel
ayrıca , Seitz K- S klarifiye filtre kağıdından süzülmüştür.
Virusun BHK hücresinde enfektivite titresi CPE test'i ile,
areton ı B le muamele4en önce, (AT) ve sonra (ATAT) antij~nik
titreleri de semi- kantitatif complement- fixation test' i ' ile ' yapılmıştır.
5 ml lik sığır aşı dozuna 2 ml virus ilave edilmiştir.
Aşılar formulle inaktive olup, adjuvant olarak sapanin kullanılmıştır.
Virusun enfektivite ve antijenik titreleri ile eprüvasyon sonuçları
çok tatminkar olup, (Tablo : ı) de gösterilmiştir

Anahtar Kelimeler

Şap Virus, Şap, Virus, Hücre Kültürü, Hamster Böbreği

Kaynakça

• 1 - Amighi M. (1964) : Bull. Off. Int. Epiz. 61, '934- 944
• 2 - Bengels<lorff H. J . ve Schneider B. (1964) : Bull. 'Off. Int. Epiz. 61, 1197 1208 '
• 3 - Capstick. P. B. (1963) : Proc. Roy. Soc. Med. 56, 1062- 1064
• 4 - Capstick P. B. ve Garland A. J. (1965) : Bull. Off. Int. Epiz. 64, 215 - 223
• 5 - Capstick P. B. Garland A. J., Chapman W.G. ve Masters R. C. (1965) :Nature 205, 1135 - 1136
• 6 Capstick P. B., Telling- R. C., Chapman ,V. C. ve Doreen L. Stewart (1962) : Nature, 195, 1163 - 1164 .
• 7 Girard H. C. Sütçü M., Şentürk M., Okay G., Bayramoğlu O., Ünlüleblebici N., Oral M., Boz C., : Concentrated Foot and Mouth Disease Vaccine From Cell Culture. Report of the meeting of the Research gruop of the FAO Standing Technical Committe at the Animal virus Research Institute Pirbright 11-16 Sept. 1966 P. 66
• 8 - Kane G. J. Pay T. W. F., ve Bracewell C. D. (1965) : Bull. Off. Int. Epiz.64, 225 - 230 .
• 9 - Keeble S. A. ve Heymann C. S. (1965) : Nature 206, 1125 1126
• 10 - Mammerick M. ve Leumen J . (1966) : Bull. Off. Int. Epiz. 65, 337- 348
• 11- Mewat G. N. ve Chapman W. G. (1962) : Nature, 194, 253 - 355
• 12 - Nottebohm A. Gaggero A. C., Gomes I. ve Cunha R. C. (1954) : Bull. Off.Int. Epiz. 61, 919 - 933
• 13 Polatnick J. ve Bachrach H. L. (1964) : Appl. Microbiol 12, 368 - ·373
• 14 Rivenson S. ve Segura M. (1963) : Rev. Invest. ganaderas 16. 293 - 299
• 15 - Schneider B.; Jaeger O. ve Bengelsdorff H. J. (1964) : Bull. Off. Int.Eniz. 61, .1013 - 1023
• 16 - Segura de Aramburu M. ve Rivenson S. (1968) : Rev. Invest. Agropecuarias,Vol. V No. 4, 31 - 37
• 17 - Ubertini B. Nardelli L., Dalnrato A., Panina G. ve Santero G. (1963) :Zbl. Vet. Med ., Reihe B., 10, 93 - 101
• 18 - Ubertini B. Nardeili L .. Dal Prato A .. Panina G. ve Santero G. (1963) :6R Report of the meeting of the Research Group of the standing Technical committee at the animal virus Research Institute, Birthright England14 - 16 Sept. 1966 p . 55 - 65.