Comparison of PCR and Bacteriological Culture to Diagnose Brucella Species in Clinical Samples Collected from Cows in Brucellosis Suspected Herds

Abstract

In this study, we compared PCR and bacteriological culture methods to detect Brucella species in milk, blood (buffy coat) and vaginal swabs collected from cows in suspected herds in Şanlıurfa Province. Of 68 sera and milk samples tested, 35 sera (51.4%) and 39 milk samples (57.4%) were positive by Rose Bengal Plate Test (RBPT) and Milk Ring Test (MRT), respectively. A total of 15 (22%) Brucella spp. were isolated from the milk samples. All the isolates were identified as B. abortus biotype 3. We failed to isolate Brucella spp. from both buffy coat portion of blood samples and vaginal swabs. After DNA extractions from the clinical samples, a genus specific PCR was used to detect DNA in milk, buffy coats and vaginal swabs. PCR products with a molecular size of 223 bp were obtained from 11 milk (16.2%) and 6 buffy coats (8.8%) samples. No amplification could be made from vaginal swabs. Neither bacterial isolation nor DNA amplification was ever detected from serologically negative animals. All isolates were revealed B.abortus by Bruce ladder multiplex PCR. Compared with culture, sensitivity and specificity of milk PCR were determined as 78.9% and 100%, respectively. According to the results, we thought that low sensitivity of cultural isolation and PCR in blood, milk and vaginal swabs materials could be due to intermittent shedding of the agent through milk and vaginal secretions and variation of bacterial load in the blood according to the stages of infection. Therefore, it was concluded that combination of bacteriological, serological and molecular methods could be very useful for definitive diagnosis of the disease, especially in samples with low bacterial load.

Keywords

• Brucella abortus, PCR, Milk, Brucella spp. isolation, diagnosis

Brusellozis Şüpheli Sürülerdeki İneklerden Alınan Klinik Örneklerden Brucella spp. Tanısı İçin PCR ve Bakteriyolojik Kültür Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Abstract

Bu çalışmada, Şanlıurfa İlinde brusella infeksiyonu olduğu düşünülen sürülerdeki ineklerden alınan 68 adet kan (akyuvar kısmı), serum, süt ve vajinal sıvap örneklerinden Brucella etkenlerinin tanısı için bakteriyolojik kültür ve PZR yöntemlerinin karşılaştırılması hedeflendi. Serum örneklerinin Rose Bengal Pleyt Test (RBPT) antijeni ile aglütinasyon testinde 35 örnek (% 51,4) ve süt örneklerinin Süt Ring Testi (SRT) ile analizinde ise 39 süt örneği pozitif bulundu (% 57,4). Süt örneklerinden 15 (% 22) adet Brucella spp. izolasyonu gerçekleşti. Tüm izolatlar B. abortus biyotip 3 olarak identifiye edildi. Akyuvar kısmından ve vaginal sıvaplardan Brucella spp. izolasyonu yapılamadı. Klinik örneklerin tümünün DNA ekstraksiyonlarının ardından yapılan cins spesifik PZR sonucu, süt örneklerinin 11’inden (% 16,2) ve akyuvar örneklerinin 6’sından (% 8,8) 223 bp’lik DNA amplifikasyonu saptanırken, vaginal sıvapların hiçbirinden DNA amplifikasyonu gerçekleştirilemedi. Serolojik olarak negatif inekler kültürel ve moleküler yönden negatif bulundu. İzole edilen Brucella kültürlerine yapılan Bruce ladder multipleks PZR sonucu 15 izolatın tümü B.abortus profili gösterdi. Bakteriyel kültür altın standart olarak alınarak, süt örneği için PZR duyarlılığı % 78,9 ve özgüllüğü % 100 olarak belirlendi. Sonuç olarak, kan ve vaginal sıvaplardan bakteriyel izolasyonun yapılamaması ve PZR duyarlılığının bu örneklerde düşük olmasının nedeninin, hastalığın doğası gereği etkenin aralıklı olarak süt ve vajinal akıntılar ile atılmasına ve kanda bakteri yükünün hastalığın evrelerine göre değişebilmesine bağlı olduğu düşünülmüştür. Bu nedenle gerek kültür ve gerekse DNA amplifikasyonu için kan, süt ve vajinal sıvap örneklerinin etkeni atık materyallere göre daha az taşıyabileceğinin akılda tutulmasının ve hastalığın kesin tanısı için bakteriyel serolojik ve moleküler tanı yöntemlerinin kombine olarak kullanılmasının önemli olduğu sonucuna varılmıştır

Keywords

• Brucella abortus, PZR, süt, Brucella spp. izolasyonu, teşhis