Comparison Of Different Molecular Methods In Screening Genetically Modified Lentil

Abstract

Currently transgenic plants are grown in more than 20 countries with maize, soybean, canola and cotton being the most predominant crops. Inexperience in the outcomes of the technology and growing public concern necessitates proper detection and regulation of genetically modified organisms (GMOs) from farmland to market. Due to their high specifity and sensitivity, polymerase chain reaction (PCR) based systems are currently the method of choice in detection of genetic modifications. This study compares the efficiency of three different PCR based methods; reversetranscription PCR (RT-PCR), real-time PCR (qPCR) and conventional PCR in reference with the transgene copy numbers assessed by Southern blot hybridization, in detection of genetic modification. In the study, first generation transgenic lentil (Lens culinaris M.) plants carrying beta-glucuronidase (gus) gene in control of CaMV-35S promoter and A.tumefaciens nos terminator was used. Conventional PCR was used in detection of gus gene signal and RT PCR was performed in detection of gene’s expression. qPCR was used to detect expression signals of both 35S promoter and nos terminator. All of the methods were successful in producing amplification signals for each target gene. Although qPCR signal strengths were in consistency with the band intensities obtained by RT-PCR to some extent, outcomes of both PCR-based methods appeared to be independent from copy number of genes detected in Southern blot hybridization. Band intensities obtained by conventional PCR showed no particular correlation with any other PCRbased method. Inconsistency in copy number of gene and qPCR signal strength, even in pure DNA samples may have a contribution for the debates on the influence of various factors on qPCR and reliability of the method in genetic modification quantification.  

Keywords

• Real time PCR
• reverse transcription PCR
• conventional PCR
• lentil
• genetically modified organism

Genetiği Değiştirilmiş Mercimeğin Taranmasında Farklı Moleküler Yöntemlerin Karşılaştırılması

Abstract

Transgenik bitkiler günümüzde, başlıca mısır, soya fasülyesi, kanola ve pamuk olmak üzere yirmiyi aşkın ülkede yetiştirilmektedir. Rekombinat DNA teknolojisinin ortaya çıkarabileceği sonuçlarla ilgili deneyimsizlik ve artmakta olan toplumsal kaygılar, genetiği değiştirilmiş organizmaları (GDOlar), tarladan markete kadar gerektiği anda tespit edebilmeyi ve gerekli düzenlemeler getirmeyi gerekli kılar. Yüksek spesifite ve duyarlılıkları nedeniyle polimeraz rincir reaksiyonuna (PZR) dayalı sistemler günümüzde genetik modifikasyonların tespitinde en çok tercih edilen yöntemlerdir. Bu çalışmada, PCR’a dayalı üç farklı yöntem olan ters ifadeli PZR (RT-PZR), gerçek zamanlı PZR (qPZR) ve geleneksel PZR, genetik modifikasyon tespitinde, Southern blot hibridizasyonu ile belirlenen transgen kopya sayıları referans alınarak karşılaştırılacaktır. Çalışmada, CaMV-35S promotoru ve A.tumefaciens nos terminatörü kontrolünde beta-glukoronidaz (gus) geni taşıyan birinci nesil transgenik mercimek bitkileri kullanılmıştır. Geleneksel PZR, gus gen sinyalinin belirlenmesinde, RT-PZR, gen ifadesinin belirlenmesinde kullanılmıştır. qPCR ise 35S promotor ve nos terminator ifade sinyallerinin belirlenmesinde kullanılmıştır. Kullanılan tüm yöntemler, hedef gen için çoğaltım sinyalleri üretmede başarılı olmuştur. qPCR sinyal yoğunlukları RT-PZR tarafından oluşturulan bant yoğunluklarıyla bir ölçüde tutarlılık göstermekle birlikte, PZR’ye dayalı bu iki yöntemle elde edilen sonuçlar Southern blot hibridizasyonuyla belirlenen gen kopya sayılarından bağımsız görünmektedir. Geleneksel PZR ile elde edilen bant yoğunlukları ise diğer PZR’ye dayalı yöntemlerle belirli bir ilişki göstermemiştir. Saf DNA örneklerinde ölçülmüş olan genin kopya sayısı ve qPZR sinyal yoğunluğu arasındaki tutarsızlığın, çok çeşitli faktörlerin qPZR üzerindeki etkileri ve yöntemin genetik modifikasyonun sayısallaştırılmasındaki güvenilirliği üzerine yapılan tartışmalara katkıda bulunabileceği düşünülmektedir. 

Keywords

• Gerçek zamanlı PZR
• ters ifadeli PZR
• geleneksel PZR
• mercimek
• genetiği değiştirilmiş organizma

References

1. Mafra, I., Ferreira, M.P.L.V.O., Beatriz, M. and P.P. Oliveira, 2008. “Food authentication by PCR-based methods” Eur Food Res Technol, Vol. 227, pp.649–665.
2. Anklam, E., Gadani, F., Heinze, P., Pijnenburg, H. and G. Van Den Eede, 2002. “Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural cropsand plant-derived food products” Eur Food Res Technol, Vol. 214, pp.3–26.
3. Cankar, K., Chauvensy-Ancel, V., Fortabat, M.N., Gruden, K., Kobilinsky, A., Jana, Z. and Y. Bertheau , 2008. “Detection of nonauthorized
4. differentialquantitative polymerase chain reaction: application to 35S in maize” Analytical Biochemistry, Vol. 376, pp. 189–199. modified organisms
5. using [4] Giovannini, T. and L. Concilio, 2002. “PCR Detection of Genetically Modified Organisms: A Review” Starch/Stärke, Vol. 54, pp. 321–327.
6. Studer, E., Rhyner, C., Lüthy, Y. and P. Hübner, 1998. “Quantitative competitive PCR for the detection of genetically modified soybean and maize” Z. Lebensm Unters Forsch, Vol. 207, pp. 207–213.
7. F.E. Ahmed, 2002. “Detection of genetically modified organisms in foods” TRENDS in Biotechnology, Vol.20, pp. 215-223.
8. Yates, K., ed., 1999. Detection Methods for Novel Foods Derived from Genetically Modified Organisms ILSI Europe

9. De Graaff, L.H., van den Broeck, H.C. and J. Visser, 1988. “Isolation and transformation of the pyruvate kinase gene of Aspergillus nidulans” Current Genetics, Vol. 13, pp. 315–321.
10. Fandke, M., Schneider, A., Gronewald, C. and K. Berghof-Jager, 2002. “Real-Time PCR Screening of Genetically Modified Organisms with the LightCycler Instrument” Biochemica, Vol. 2, pp. 14-16.
11. Brown T., 2005. Analysis of DNA Sequences by Blotting and Hybridization. In Current Protocols in Molecular Biology (E.W. Harkins, eds.), John Wiley and Sons, UK.