Effects of Different Fixation Processes On Liver Size: A Stereological Study

Abstract

Objective: As it is well known, the first stage of microscopic processes is fixation. Formaldehyde and pair of gluteraldehyde-osmium tetraoxide are commonly used in light and electron microscopical process respectively. Aim of this study was to evaluate effects of both fixatives on liver size by Cavalieri principle, a stereological technique. Material and Methods: In the present study, 5 adult, female Sprague Dawley rats were utilized. After volumes of removed livers were determined by water immersion method, handled liver samples were fixed in 10% formaldehyde solution for light microscopical examination (group 1; n= 10 liver pieces). In electron microscopical process, it was carried out post-fixation by 1% osmium tetraoxide buffered 0.2 M phosphate after pre-fixation, made by 3% gluteraldehyde buffered with 0.2 M phosphate (group 2; n= 10 liver pieces). Then thick (5 µm), semi-thin (1 µm) sections handled from all blocks were photographed via light microscope with camera attachment and liver volumes were measured with Cavalieri principle on this images. Consequently the results of two groups were compared with each other and it was evaluated statistically. Results: According to our results, mean liver volumes via water immersion method and liver volumes of two groups were estimated as 9.178, 9.104-8.522 mm3 respectively. Difference between both mean volume values of two groups and between volumetric values by water immersion method and the second group was significant, statistically (p< 0, 05; Independent Samples T Test). Conclusions: In the literature, some studies are available about comparison of fixation effectiveness between formaldehyde and glutaraldehyde-osmium tetraoxide in specially immunohistochemical studies. But there is not any study concerning effects of these fixatives on liver size till now. Finally, in this study, different effects of formaldehyde and combination of glutaraldehyde-osmium tetraoxide on liver volume were indicated with stereological approachment, an unbiased method. Key words: Fixation, Microscopy, Stereology, Cavalieri Principle.

Keywords

• Fixation, Microscopy, Stereology, Cavalieri Principle.

Farklı Fiksasyon İşlemlerinin Karaciğer Boyutu Üzerine Etkisi: Stereolojik Bir Çalışma

Öz

Amaç: Bilindiği gibi mikroskobik takip işlemlerinin ilk aşaması fiksasyondur. Işık mikroskobik takip işlemlerinde formaldehit elektron mikroskobik takip işlemlerinde ise gluteraldehit-osmium tetraoksit ikilisi fiksasyon amacıyla yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada her iki fiksatif kullanımının karaciğer boyutu üzerindeki etkisinin stereolojik bir teknik olan Cavalieri Prensibi ile değerlendirilmesi amaçlandı. Gereç ve Yöntem: Çalışmada 5 adet erişkin, dişi Sprague Dawley cinsi sıçan kullanıldı. Her denekten alınan karaciğerlerin hacimleri suya daldırma metodu (SDM grubu) ile ölçüldükten sonra alınan karaciğer örnekleri ışık mikroskobik inceleme için %10'luk formaldehit ile fiksasyon işlemine tabi tutuldu (grup 1; n= 10 parça karaciğer). Elektron mikroskobik incelemede ön fiksasyon için %3'lük gluteraldehit ve post fiksasyon için % 1'lik fosfat tamponlu osmium tetraoksit kullanıldı (grup 2; n=10 parça karaciğer). Daha sonra tüm bloklardan elde edilen kalın (5 µm) ve yarı ince (1 µm) seri kesitler kameralı bir ışık mikroskobu yardımıyla fotoğraflandı ve bu fotoğraflar üzerinde Cavalieri metodu(CM) ile hacim ölçümü yapıldı. Takiben elde edilen sonuçlar kıyaslandı ve istatistiksel olarak değerlendirildi. Bulgular: Çalışmamızın sonuçlarına göre SDM grubu, grup 1 ve grup 2' ye ait karaciğerlerin ortalama hacimleri sırasıyla 9.178, 9.104 ve 8.522 mm3 olarak hesaplandı. Hem grup 1 ve 2'nin hacim değerleri arasında hem de SDM grubu ile 2. grubun sonuçları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmaktaydı (p< 0,05; Independent Samples T Test). Sonuç: Literatürde özellikle immünohistokimyasal çalışmalarda gluteraldehit- osmium tetraoksit çifti ve formaldehitle fiksasyonun etkinliğinin kıyaslandığı çalışmalar mevcuttur. Fakat günümüze kadar bu fiksatiflerin karaciğer boyutu üzerine etkisi ile ilgili herhangi bir çalışma yapılmamıştır. Bu çalışmada gluteraldehit-osmium tetraoksit kombinasyonu ve formaldehitin karaciğer boyutu üzerinde farklı etkileri olduğu tarafsız bir yöntem olan stereolojik yaklaşımla gösterilmiştir. Anahtar kelimeler: Fiksasyon, Mikroskopi, Stereoloji, Cavalieri Prensibi.

Anahtar Kelimeler

• Fiksasyon, Mikroskopi, Stereoloji, Cavalieri Prensibi.

References

1. Sonmez OF, Unal B, Inaloz S, et. al. Therapeutic effects of intracarotid infusion of spermine/nitric oxide complex on cerebral vasospasm. Acta Neurochir (Wien) 2002;144(9):921-8.
2. Gagliardo KM, De Carvalho Balieiro JC, De Souza RR, et. al. Postnatal-related changes in the size and total number of neurons in the caudal mesenteric ganglion of dogs: total number of neurons can be predicted from body weight and ganglion volume. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 2005;286(2):917-29.
3. Sahin B, Emirzeoglu M, Uzun A, et. al. Unbiased estimation of the liver volume by the Cavalieri principle using magnetic resonance images. Eur J Radiol 2003;47(2):164- 70.
4. Bancroft JD, Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques; 4th edition. Edinburgh: Churchill Livingstone 1986: 20-35.
5. Hayat MA. Principles and Techniques of Electron Microscopy; 3rd edition. London: The Mac Millan Press Ltd 1989: 57-67.
6. Odaci E, Sahin B, Sonmez OF, et. al. Rapid estimation of the vertebral body volume: a combination of the Cavalieri principle and computed tomography images. Eur J Radiol 2003;48(3):316-26.
7. Nielsen BS, Lund LR, Christensen IJ, et. al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol 2001;158(6):1997-2003.
8. Ladekarl M, Jensen V, Nielsen B. Stereologic estimation of breast tumor size. Anal Quant Cytol Histol 1996;18(2):151-7.

9. Okur A, Kantarci M, Akgun M, et. al. Unbiased estimation of tumor regression rates during chemoradiotherapy for esophageal carcinoma using CT and stereology. Dis Esophagus 2005;18(2):114-9.
10. Gundersen HJ, Jensen EB. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc 1987;147 (3):229-63.
11. Hayashi T, Nagayasu T, Kohno S, et. al. Better choice of fixatives provides better histological details of the alveolar-capillary interface. Pathology 2005;37(5):355-9.
12. McNulty V, Cruz-Orive LM, Roberts N, et. al. Estimation of brain compartment volume from MR Cavalieri slices. J Comput Assist Tomogr 2000;24(3):466-77.
13. Sahin B, Aslan H, Unal B, et. al. Brain volumes of lamb, rat and bird do not show hemispheric asymmetry:A stereological study. Image Anal Stereol 2001; 20:9-13.