Buffy-Coat Konsantrelerindeki Nötrofillerin Oksidatif Patlama Kapasitelerinin Analizi

Abstract

Buffy-Coat konsantreleri (BFC'ler) febril nötropenisi olan hastalarda nötrofil desteği sağlamak için transfüze edilmektedir. Bu çalışmada, BFC'deki nötrofillerin oksidatif patlama kapasitesi araştırıldı. 12 saat depolanmış BFC'ler (n=16), sağlıklı gönüllülerden alınan örnekler (n=7) (taze EDTA; fEDTA) ve BFC bağışlayan kan bağışçılarından bağış öncesi alınan örnekler (n=16) (donör EDTA; dEDTA) çalışmaya dahil edildi. fEDTA ve dEDTA örnekleri zamanın oksidatif patlama üzerindeki etkisini değerlendirmek amacıyla çalışmaya dahil edildi. Oksidatif patlamayı değerlendirmek için Nitroblue tetrazolium (NBT) testi farklı titrasyonlarda phorbol miristat asetat (PMA) ile gerçekleştirildi. PMA'nın 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 titrasyonlarında oksidatif patlama %95'ten yüksek bulunduğundan, çalışmaya 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 titrasyonları ile devam edildi. Ayrıca PMA eklenmemiş BFC örnekleri negatif kontrol olarak kullanıldı. Negatif kontroldeki fEDTA örnekleri ile BFC örneklerinde benzer oksidatif patlama düzeyleri belirlenirken, dEDTA örneklerinde oksidatif aktivite istatistiksel olarak yüksek bulundu. Bu sonuçlar dEDTA'da bulunan nötrofillerin spontan olarak aktive olabileceğini düşündürdü. dEDTA ve BFC örneklerindeki oksidatif patlama kapasitesi 1:64 PMA titrasyonu hariç tüm PMA titrasyonlarında fEDTA örneklerine göre anlamlı düzeyde düşük bulundu. Ayrıca artan titrasyona bağlı olarak oksidatif kapasitenin tüm gruplarda önemli ölçüde azaldığı tespit edildi. PMA’sız dEDTA örneklerinde spontan patlama tespit edilirken BFC örneklerinde tespit edilmemesi, BFC'deki ek solüsyonun nötrofilleri spontan aktivasyondan koruduğunu göstermektedir. fEDTA örneklerine göre anlamlı azalmaya rağmen, BFC’lerdeki nötrofillerin tüm titrelerde (%75'in üzerinde) yüksek oksidatif aktivite göstermeleri işlevsel kalabildiklerini düşünülmektedir. Elde edilen sonuçlar BFC içindeki nötrofillerin transfüzyon yapıldığında işlev görebileceklerini düşündürmekte, ayrıca deneylerde BFC'leri nötrofil kaynağı olarak kullanabileceğimizi göstermektedir.

Keywords

• Buffy-Coat Konsantreleri
• Nitroblue Tetrazolium Testi
• Oksidatif Patlama
• Nötrofil

Analysis of Oxidative Burst Capacity of Neutrophils in Buffy-Coat Concentrates

Abstract

Buffy-Coat concentrates (BFCs) can be transfused to provide neutrophil support in patients with febrile neutropenia. In this study, the oxidative burst capacity of neutrophils in BFC was investigated in 12 hours-stored BFCs (n=16). Samples taken from healthy volunteers (n=7) (fresh EDTA; fEDTA) and taken before donation from blood donors who donated BFCs (n=16) (donor EDTA; dEDTA) were included. fEDTA and dEDTA samples were used to compare the effect of time. Nitroblue tetrazolium (NBT) test was performed to evaluate the oxidative burst. Different titrations (1:16, 1:32, 1:64, 1:128) of phorbol myristate acetate (PMA) were used. BFC samples without PMA addition were used as negative control (NC). While similar results were obtained in BFC samples with fEDTA samples in NC, oxidative activity was statistically high in the dEDTA samples. These results suggested that neutrophils in dEDTA may be spontaneously activated. In all PMA titrations except 1:64 PMA titers, the oxidative burst capacity in dEDTA and BFC samples was significantly lower than that in fEDTA samples. Also, oxidative burst significantly decreased in fEDTA-dEDTA-BFC in all PMA titrations. Spontaneous burst was detected in dEDTA samples under PMA-free conditions, but not in BFC samples, indicating that the additive solution in BFC protected neutrophils from spontaneous activation. Despite the statistically significant decrease, neutrophils in BFCs can remain functional due to their high oxidative activity at all titers (above 75%). This indicates that they can function when transfused. This result also shows that we can use BFCs as a source of neutrophils in experiments.

Keywords

• Buffy-Coat Concentrates
• Nitroblue Tetrazolium Test
• Oxidative Burst
• Neutrophil

References

1. 1.Blanter M, Gouwy M, Struyf S. Studying Neutrophil Function in vitro: Cell Models and Environmental Factors. J Inflamm Res. 2021;14:141-162. doi:10.2147/JIR.S284941
2. 2.Gupta S, Chan DW, Zaal KJ, Kaplan MJ. A High-Throughput Real-Time Imaging Technique To Quantify NETosis andDistinguish Mechanisms of Cell Death in Human Neutrophils. J Immunol. 2018;200(2):869-879. doi:10.4049/JIMMUNOL.1700905
3. 3.Zhang N, Aiyasiding X, Li W jing, Liao H han, Tang Q zhu.Neutrophil degranulation and myocardial infarction. CellCommun Signal. 2022;20(1):1-23. doi:10.1186/S12964-022-00824-4
4. 4.Griffin FM, Griffin JA, Leider JE, Silverstein SC. Studies onthe mechanism of phagocytosis. I. Requirements for circumferential attachment of particle-bound ligands to specific receptors on the macrophage plasma membrane. J Exp Med. 1975;142(5):1263-1282. doi:10.1084/JEM.142.5.1263
5. 5.Nordenfelt P, Tapper H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. J Leukoc Biol. 2011;90(2):271-284. doi:10.1189/JLB.0810457
6. 6.Naish E, Wood AJT, Stewart AP, et al. The formation and function of the neutrophil phagosome. Immunol Rev.2023;314(1):158-180. doi:10.1111/IMR.13173
7. 7.Estcourt LJ, Stanworth S, Doree C, et al. Granulocytetransfusions for preventing infections in people withneutropenia or neutrophil dysfunction. Cochrane database Syst Rev. 2015;2015(6):1-65. doi:10.1002/14651858.CD005341.PUB3
8. 8.Estcourt LJ, Stanworth SJ, Hopewell S, Doree C, Trivella M,Massey E. Granulocyte transfusions for treating infections in people with neutropenia or neutrophil dysfunction. Cochrane Database Syst Rev. 2016;2016(4):1-76. doi:10.1002/14651858.CD005339.PUB2

9. 9.Cugno C, Deola S, Filippini P, Stroncek DF, Rutella S. Granulocyte transfusions in children and adults withhematological malignancies: Benefits and controversies. JTransl Med. 2015;13(1):1-17. doi:10.1186/S12967-015-0724-5/TABLES/3
10. 10.West KA, Conry-Cantilena C. Granulocyte transfusions: Current science and perspectives. Semin Hematol. 2019;56(4):241-247. doi:10.1053/J.SEMINHEMATOL.2019.11.002
11. 11.Ramachandran M, Gupta AK, Meena JP, et al. A randomized controlled trial to explore the safety and efficacy of irradiated buffy-coat granulocytes in pediatric patients with febrile neutropenia. Am J Blood Res. 2023;13(5):152-161.
12. 12.Gupta AM, Ojha S, Sumathi SH, Poojary M. A Case Report ofApheresis Granulocyte Concentrates and the Whole Blood-Derived Pooled Buffy Coat Transfusions in a Neutropenic Hematopoietic Stem Cell Transplant Recipient. Glob J Transfus Med. 2021;6(1):106-109. doi:10.4103/GJTM.GJTM_97_20
13. 13.Sahlin A, Blomgran R, Berlin G. Granulocyte concentrates prepared from residual leukocyte units produced by the Reveosautomated blood processing system. Transfus Apher Sci. 2020;59(2):102682. doi:10.1016/J.TRANSCI.2019.102682
14. 14.Klinkmann G, Doss F, Doss S, et al. Purified Granulocyte Concentrates from Buffy Coats with Extended Storage Time.Transfus Med Hemother. 2024;51(6):383-392. doi:10.1159/000537698
15. 15.Bashir S, Stanworth S, Massey E, Goddard F, Cardigan R. Neutrophil function is preserved in a pooled granulocyte component prepared from whole blood donations. Br JHaematol. 2008;140(6):701-711. doi:10.1111/J.1365-2141.2008.06996.X
16. 16.Klinkmann G, Doss F, Goudeva L, et al. Prolonged storage of purified granulocyte concentrates: Introduction of a newpurification method. Transfusion. 2022;62(1):194-204. doi:10.1111/TRF.16732