Brucella melitensis dış membran protein geni Omp31’in klonlanması

Abstract

Bruselloz hayvanlardan veya hayvansal ürünlerden insanlara bulaşan en önemli zoonotik hastalıklardan birisidir. Brucella melitensis, brusella cinsi içerisinde en patojen türlerden birisidir. B. melitensis'in dış membran proteini 31 (Omp31) koruyucu bir immünojen ve önemli bir aday aşı olarak kabul edilmektedir. Bu çalışmada, B. melitensis Rev 1 suşundan Omp31’i kodlayan genin (omp31) klonlanması amaçlandı. Çalışmada materyal olarak B. melitensis REV-1 canlı aşı suşu kullanıldı. Suşun canlandırılmasının ardından, DNA ekstraksiyonu yapıldı. Dış membran proteini kodlayan gen bölgesi, gen bankasından bulundu. Bu bölgeyi klonlamak için gerekli primerler manuel olarak dizayn edildi. Primer dizaynından sonra polimeraz zincir reaksiyonu yoluyla çoğaltılan gen bölgesi, pET28a ekspresyon vektörüne klonlanarak Escherichia coli BL21 bakterisine transformasyonu gerçekleştirildi. E. coli BL21’den plazmid ekstraksiyonu yapıldı. Klonlama için kullanılan restriksiyon enzimi ile kesim sonucunda insert ve plazmid ayrı olarak gözlemlendi. Beklenen büyüklükte (790 bp) bulunan insert, tekrar klonlama primeri ile çoğaltılarak doğrulamak amacıyla sekans analizi yapıldı. Sekans analizi sonrasında elde edilen dizi gen bankası ile karşılaştırıldı ve insertin B. melitensis dış membran proteini olduğu doğrulandı. Bundan sonraki yapılacak çalışmalarla da klonlanan rekombinant dış membran proteini Omp31 (rOmp31)’in antijenik özelliğinin araştırılarak aşı adayı olma potansiyelinin belirlenmesi gerekmektedir.

Keywords

• Brucella melitensis,klonlama

Cloning of outer membrane protein gene Omp31 Brucella melitensis

Abstract

Brucellosis is one of the most important zoonotic diseases transmitted to humans from animals or animal products. Brucella melitensis is the most pathogenic species in the genus brucella. The outer membrane protein 31 (Omp31) of B. melitensis is considered to be a protective immunogen and an important candidate vaccine. In this study, cloning from B. melitensis Rev 1 strain of Omp31 coding gene (omp31) was aimed. Brucella melitensis REV-1 live vaccine strain was used in the study. After reactivation of strain, DNA was extracted from bacterial culture. Gene sequence which encodes outer membrane protein was obtained from Gene Bank. Primers were designed to clone this region. After primer design, the gene region amplified by the polymerase chain reaction was cloned into the pET28a expression vector and transformed into Escherichia coli BL21 bacteria. Plasmid extraction was performed from E. coli BL21. The insert and plasmid were separately observed as a result of cutting with the restriction enzyme used for cloning. Expected size (790 bp) insert amplified with cloning primers again and amplicon was sequenced. The sequence obtained after sequencing analysis was compared to the gene bank and confirmed to be the outer membrane protein of B. melitensis. Further studies are required to investigate the antigenic properties of the cloned recombinant outer membrane protein Omp31 (rOmp31) and determine the potential to be a candidate for vaccination.

Keywords

• Brucella melitensis,cloning

References

1. Cassataro J, Pasquevich KA, Estein SM, et al. (2007): A recombinant subunit vaccine based on the insertion of 27 amino acids from Omp31 to the N-terminus of BLS induced a similar degree of protection against B. ovis than Rev. 1 vaccination. Vaccine, 25, 4437-46.
2. Cloeckaert A, Jacques I, Grilló MJ, et al. (2004): Development and evaluation as vaccines in mice of Brucella melitensis Rev.1 single and double deletion mutants of the bp26 and omp31 genes coding for antigens of diagnostic significance in ovine brucellosis. Vaccine, 29, 2827-35.
3. Cloeckaert A, Vizcaino N, Paquet JY, et al. (2002): Major outer membrane proteins of Brucella spp.: past, present and future. Vet Microbiol, 90, 229-47.
4. Ding XZ, Bhattacharjee A, Nikolich MP, et al. (2005): Cloning, expression, and purification of Brucella suis outer membrane proteins. Protein Expr Purif, 40, 134-41.
5. Dubray G, Bezard G (1980): Isolation of three Brucella abortus cell-wall antigens protective in murine experimental brucellosis. Ann Vet Res, 11, 367- 73.
6. Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı Gıda ve Kontrol Genel Müdürlüğü (2012): Brusellanın konjuktival aşı ile kontrol ve eradikasyonu projesi. Genelge No: 2012/03.
7. Kittelberger R, Hilbink F, Hansen MF, et al. (1995): Identification and characterization of immunodominant antigens during the course of infection with Brucella ovis. J Vet Diagn Invest, 7, 210-8.
8. Monreal D, Grilló MJ, González D, et al. (2003): Characterization of Brucella abortus O-polysaccharide and core lipopolysaccharide mutants and demonstration that a complete core is required for rough vaccines to be efficient against Brucella abortus and Brucella ovis in the mouse model. Infect Immun, 71, 3261-71.

9. Office International des Epizooties (OIE) (2016): World Organization for Animal Health: Chapter 2.1.4. Brucellosis. http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.04_BRUCELLOSIS.pdf.
10. Sambrook J, Russell D (2001): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
11. Shojaei M, Tahmoorespur M, Soltani M, et al. (2018): In silico cloning and bioinformatics study of Brucella melitensis Omp31 antigen in different mammalian expression vectors. J Livest Sci Technol, 6, 65-76.
12. Turner PC, Mclennan AG, Bates AD, et al. (2004): Moleküler Biyoloji Önemli Notlar. Nobel Yayınları.
13. Vahedi F, Talebi AF, Ghorbani E, et al. (2011): Isolation, cloning and expression of the Brucella melitensis Omp31 gene. Iran J Vet Res, 12, 156-62.