Bozok Tıp Dergisi

Öz

ÖZET

Giriş: Ankaferd
kan stoper (ABS) folklorik tıbbi bitki ekstraksiyonudur. Ülkemizde yıllardır
geleneksel hemostatik ajan olarak kullanılmaktadır. ABS Thymus vulgaris,
Glicirhiza glabra, Vitis vinifera, Alpinia officinarum ve Urtica dioica
bitkilerinin standardize edilmiş bir karışımıdır. Bu bitkilerin hepsinin
bireysel olarak endotel, kan hücreleri, anjiogenez, hücre proliferasyonu,
vasküler dinamikler ve mediatörler üzerine etkisinin olabileceği rapor
edilmiştir. Bu çalışmanın amacı in vitro endotel hücre çoğalmasının ABS'nin
farklı zaman ve dozlarının in vitro apoptotik etkilerini araştırmaktır.

Gereç
ve yöntem: Erciyes Üniversitesi hastanesinde
sezeryanla yapılan doğumlardan alınan göbek bağı toplardamarı PBS ile yıkandıktan sonra içine yaklaşık 10 mg/ml kollajenaz verildi ve 10 dakika 37ºC de
inkübatörde bekletildi. Damar içerisindeki hücre ve kollajenaz karışımı tüp
içine alındıktan ve 30 ml besi yeri ilave edildikten sonra 1000 rpm’de 10
dakika santrifüj edildi. Üstteki supernatant atıldı ve tüpün dip kısmında
biriken hücreler üzerine 2 ml besi yeri ilave edilerek karıştırıldı ve 25
cm’lik flasklara ekildi. Ekilen hücreler konfluense ulaşınca pasajlama yapıldı.
Yeterince hücre elde edildikten sonra Thoma lamında sayılan hücreler gruplara
ayrıldı. Her bir gruba ait kültür ortamına sırasıyla 5 µl, 25
µl and 50 µl ABS 24 saat süre ile uygulanmıştır. 24 saat
sonra hücreler tripsin/EDTA ile muamele edildi. Hücreler tripan mavisi ile
boyandı ve ışık mikroskobu altında canlı hücreler Thoma lamında sayılarak fotoğrafları
çekildi. Daha sonra hücrelerin canlılığı ve/veya proliferasyonu MTS testii ile
tespit edildi.

Bulgular:
HUVEC‟lere ABS muamelesi boyunca, mikroskobik olarak hücrelerin yüzeyden
kalktığı ve birbirlerine yapıştığı ve 24 saat sonra ise normal büyümelerine ve
fonkiyonlarına döndükleri gözlemlenmiştir. Doza bağlı olarak deney grubu
hücrelerinde bir artışın olduğu görüldü. Kontrol ve deney gruplarından elde
edilen ortalama hücre sayısı sırasıyla 7,68x10³
(±1,7), 5,56x10³(±1,09) 4,12x10³(±1,14) ve 2,43x10³(±0,89)
idi.
Deney gruplarının kontrol grubu ile karşılaştırıldığında deney gruplarındaki
azalma istatistiksel olarak anlamlıydı (p <0,05). Deney grupları (5 µl, 25
µl ve 50 µl ABS), HUVEC'de yüksek dozda bağlı olarak birbiri ile karşılaştırıldığında
azalmış bir hücre sayısı göstermiş ve istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p
<0.05). Ayrıca, regresyon analizinin sonuçları hücre canlılığının doza bağlı
olarak azaldığını, yani dozun artmasıyla hücre ölümünün arttığını gösterdi.

Sonuç:
Çalışmamızda ABS'nin apoptotik etkisi HUVEC'de gösterildi. Apoptoz, bir hücrede
gerçekleşen biyokimyasal, morfolojik ve moleküler değişikliklerden
yararlanılarak çeşitli yöntemler aracılığı ile ölçülebilir. ABS'nin apoptotik
etkisi, kanser hastalıklarının tedavisinde alternatif bir yol olabileceğini
göstermektedir.

Abstract

Introduction: Ankaferd Blood Stopper (ABS) is an herbal extract which has
been used historically as a haemostatic agent in traditional Turkish medicine.
ABS comprises of standardized mixture of herbs T. vulgaris, G. glabra, V.
vinifera, A. officinarum and U. dioica. Basic effect mechanism of ABS is the
formation of an encapsulated protein web which represents the focus points for
the vital erythrocyte masses. The haemostatic effects have been demonstrated by
in vitro and in vivo studies. The aim of this study was to investigate the in
vitro apoptotic effects of the different times and doses of ABS on in vitro
endothelial cell proliferation.

Methods:
Human
umbilical cord obtained at Caesarean sections from Erciyes University hospital.
After washing PBS, the cord vein lumen was filled with PBS containing 10 mg/ml
collagenase and incubated 10 minute at 37°C. The contents of the vein were gently
flushed out with an equal volume of 30 ml medium collected in a conical
centrifuge tube then centrifugated at 1000 rpm for 10 minute yielded a small
white pellet which was resuspended in culture medium. The cells were plated in
2 ml of medium at T-25 plastic flasks. The endothelial cells were passaged when
confluent density was approached. The endothelial cells were incubated with
only medium in control group and different concentrations of ABS (5 µl, 25 µl
and 50 µl ABS) in the experimental groups for 24 h. After 24 hours the cells
were then detached with tripsin/EDTA solution. Cells were stained with trypan
blue and viable cells were counted with hemocytometer under the light
microscope then photographs were taken of the process steps. Then the viability
and/or proliferation of cells were detected by MTS assay.

Results: The mean cell number were obtained from the control
and experimental groups 7,68x10³ (±1,7), 5,56x10³(±1,09)
4,12x10³(±1,14), and 2,43x10³(±0,89) respectively. The
cells of the experimental groups compared with the control group to the
decrease in experimental groups was statistically significant (p<0,05).
Experimental groups (5 µl, 25 µl and 50 µl ABS) were showed a decreased cell number in HUVEC
compared with the each other depended on high dose and was found to be
statistically significant  (p<0.05).
Furthermore, the results of regression analysis showed that cell viability was
decreased depending on the dose, that was, the cell death was increased as the
dose was increased.

Conclusion: In our study, the apoptotic effect of ABS was investigated
in HUVEC. The apoptosis can be measured using various of methods by taking
advantage of the biochemical, morphological, and molecular changes undergoing
in a cell during this process. The apoptotic effect of ABS shows that it may be
an alternative way of treating cancer diseases.