Single Cell Gel Electrophoresis in DNA Damage Detection (Comet Assay)

Yıl 2010, Cilt: 19 Sayı: 4, 236 - 243, 01.12.2010

Ayşen Durmaz Nurten Dikmen Cumhur Gündüz

Öz

"Single cell gel electrophoresis (SCGE)", also called "Comet Assay", is a sensitive, reliable and rapid technique for quantifying and analyzing DNA damage in individual cells. The comet assay is widely used in living cells, researches and the applications on comet assay is becoming broader day by day. To date, the comet assay has been used for a variety of applications, including genotoxic and cytotoxic agent analyses, environmental toxicology, cancer research, and radiation biology. Briefly, in comet assay, fully frosted microscope slides were first covered with 0.5% normal melting point agarose (NMA) and air-dried at the room temperature then cells were mixed with 0.5% low melting point agarose (LMA) at 37oC to form a cell suspension which was spread onto the slide surface and let it solidified. A third layer of 0.5% low melting point agarose was then added and again allowed to solidify. After preparing the three layer agarose the slides were immersed in lysing solution at least for an hour. The slides were then placed in an electrophoresis tank which contained neutral or alkaline buffer solution and kept in there for a short while prior to electric field application. After electrophoresis, the slides were washed with neutralization solution or PBS and stained with a DNA-specific fluorescent dye and analyzed using a fluorescent microscope.

Anahtar Kelimeler

Comet Assay, DNA Damage, Single Cell Gel Electrophoresis.

DNA Hasar Analizinde Tek Hücre Jel Elektroforezi (Komet Yöntemi)

Öz

Tek hücre jel elektroforezi" ya da diğer bir adıyla "Komet Yöntemi" ökaryotik hücrelerdeki DNA hasarını hücre bazında saptayabilen duyarlı, güvenilir ve hızlı bir yöntemdir. Komet yöntemi tüm canlı hücreler üzerinde yapılan çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır ve uygulama alanı her geçen gün biraz daha genişlemektedir. Günümüzde Komet yöntemi en çok genotoksik ve sitotoksik ajanların tespitinde, çevresel toksikoloji araştırmalarında, kanser araştırmalarında ve radyasyon biyolojisinde kullanılmaktadır. Komet Yönteminde ilk olarak hücreler 37oC'de %0,5'lik düşük erime noktasına sahip agaroz (LMA) ile süspanse edilip daha önceden üzeri %0,5'lik normal erime noktasına sahip agaroz (NMA) ile kaplanmış lam üzerine aktarılır. Katılaştıktan sonra 3. tabaka olarak üzerine yine %0,5'lik LMA ilave edilir. Bu üç tabakalı jel hazırlandıktan sonra hücreler lizis solüsyonu içerisinde en az 1 saat bekletilerek parçalanır. Daha sonra lam alkali ya da nötral bir tampon içeren elektroforez tankına yerleştirilip, DNA'nın açılması için bir süre beklendikten sonra elektroforez gerçekleştirilir. Elektroforez sonrasında lam, nötralizasyon tamponu ya da PBS ile yıkanıp florokrom bir boya ile boyandıktan sonra floresan mikroskop altında incelenir.

Anahtar Kelimeler

DNA Hasarı, Komet Yöntemi, Tek Hücre Jel Elektroforezi.

Kaynakça

• Singh NP, Lai H, Khan A. Ethanol-induced single strand DNA breaks in rat brain cells. Mutat Res, 1995; 345: 191-196.
• Singh NP, Stephens RE, Schneider EL. Modifications of alkaline microgel electrophoresis for sensitive detection of DNA damage. Int. J. Radiat. Biol, 1994; 66: 23- 8.
• Anderson D, Yu TW, Philips BJ, Schmezer P. The effect of various antioxidants and other modifying agents on oxygen-radical-generated DNA damage in human lymphocytes in the Comet assay. Mutat Res, 1994; 307: 261-271.
• Agarwal A, Erenpreiss J, Sharma R. Sperm chromatin assessment. In: Gardner DK, Weissman A, Howles CM, Shoham Z. Eds. Textbook of Assisted Reproductive Technologies. 3rd edition, India: Replika Pres Pvt. Ltd, 2009:67-84.
• Durmaz A. İnfertil erkeklerdeki sperm DNA hasarının COMET ASSAY ile tayini. Doktora Tezi,
• Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Adana, 2010