Antioxidant, osmotic, and ionic responses of citrus rootstocks to salinity stress under in vitro conditions

Abstract

Soil salinity is a major abiotic stress affecting citrus cultivation globally. This study evaluates salt stress responses in two citrus rootstocks, Citrus aurantium and Poncirus trifoliata, under 0, 50, and 100 mM NaCl. Key physiological and biochemical traits were assessed, including K⁺/Na⁺ ratio, proline content, and antioxidant enzyme activities (SOD, CAT, POD). Results showed that P. trifoliata maintained a more stable K⁺/Na⁺ ratio under salinity, with only a 13.3% and 20.4% decrease at 50 and 100 mM NaCl, respectively. In contrast, C. aurantium exhibited sharper reductions (31.6% and 35.6%), indicating weaker ion homeostasis. Proline accumulation was more pronounced in C. aurantium (+27.6% at 50 mM), suggesting compensatory osmotic adjustment, whereas P. trifoliata maintained lower proline levels, owing to its ion regulation. Antioxidant responses differed between the genotypes; C. aurantium exhibited stress-induced increases in enzyme activity, while P. trifoliata maintained consistently higher basal levels regardless of salinity. The activities of SOD, CAT, and POD increased in P. trifoliata by 18.7%, 20.0%, and 15.6%, respectively, under 50 mM NaCl, while the corresponding increases in C. aurantium were limited to 10.5%, 9.3%, and 7.4%, respectively. These results indicate that the enhanced salt tolerance of P. trifoliata is closely linked to efficient ion sequestration and a pre-existing robust antioxidant system, while C. aurantium relies more on compensatory osmotic mechanisms activated under stress. 

Keywords

• Antioxidant enzymes
• Citrus aurantium
• Na/K homeostasis
• Poncirus trifoliata
• proline

In vitro koşullar altında turunçgil anaçlarının tuzluluk stresine karşı antioksidan, ozmotik ve iyonik tepkileri

Öz

Toprak tuzluluğu, turunçgil yetiştiriciliğini küresel olarak etkileyen önemli bir abiyotik strestir. Bu çalışmada, iki turunçgil anacı olan Citrus aurantium ve Poncirus trifoliata'nın 0, 50 ve 100 mM NaCl altındaki tuz stresi tepkileri değerlendirilmiştir. K⁺/Na⁺ oranı, prolin içeriği ve antioksidan enzim aktiviteleri (SOD, CAT, POD) dahil olmak üzere temel fizyolojik ve biyokimyasal özellikler değerlendirilmiştir. Sonuçlar, P. trifoliata'nın tuzluluk altında daha istikrarlı bir K⁺/Na⁺ oranını koruduğunu, 50 ve 100 mM NaCl'de sırasıyla sadece %13,3 ve %20,4'lük bir düşüş olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, C. aurantium'da K⁺/Na⁺ oranında %31,6 ve %35,6 oranlarında daha belirgin azalmalar gözlemlenmiş olup, bu durum bitkinin iyon dengesini sürdürme kapasitesinin daha zayıf olduğuna işaret etmektedir. Prolin birikimi, C. aurantium'da daha belirgin olup 50 mM NaCl uygulamasında %27,6 oranında artış göstermiştir. Bu durum, stres koşullarında devreye giren telafi edici ozmotik düzenleme mekanizmalarına işaret etmektedir. Öte yandan, P. trifoliata iyon homeostazını daha etkin biçimde sağlayarak daha düşük prolin düzeylerini koruyabilmiştir. Antioksidan yanıtlarda da anaçlar arasında farklılık gözlemlenmiştir; C. aurantium, tuzluluk stresi altında enzim aktivitelerinde artış gösterirken, P. trifoliata ise stres düzeylerinden bağımsız olarak daha yüksek bazal antioksidan enzim aktivitelerini sürdürmüştür. SOD, CAT ve POD enzim aktiviteleri, 50 mM NaCl uygulaması altında P. trifoliata’da sırasıyla %18,7, %20,0 ve %15,6 oranında artış göstermiştir. Buna karşın, C. aurantium'da aynı enzimlerdeki artışlar sırasıyla %10,5, %9,3 ve %7,4 ile sınırlı kalmıştır. Bu bulgular, P. trifoliata’nın yüksek tuz toleransının, etkili iyon tutma kapasitesi, güçlü bir antioksidan savunma sistemiyle yakından ilişkili olduğunu ortaya koymaktadır. Öte yandan, C. aurantium’un tuzluluk stresine karşı yanıtının, esas olarak ozmotik düzenleme mekanizmalarının aktive edilmesine dayandığı anlaşılmaktadır. Bu çalışma, tuz toleransı yüksek turunçgil anaçlarının belirlenmesinde fizyolojik ve biyokimyasal parametrelerin birlikte ele alınmasının bütüncül bir değerlendirme açısından kritik öneme sahip olduğunu ortaya koymaktadır.

Anahtar Kelimeler

• Antioksidan enzimler
• Citrus aurantium
• Na/K dengesi
• Poncirus trifoliata
• prolin

Kaynakça

1. Abadi, F. S. G., Mostafavi, M., Eboutalebi, A., Samavat, S., & Ebadi, A. (2010). Biomass accumulation and proline content of six citrus rootstocks as influenced by long-term salinity. Research Journal of Environmental Sciences, 4(2), 158–165. https://doi.org/10.5555/20103148123
2. Abbas, K., Javed, M., Aslam, S., Butt, F. R., Al-Ansari, M. M., Elshikh, M. S., ... & Malik, T. (2025). Co-application of potassium and thiourea for mitigating salinity stress in wheat seedlings. Scientific Reports, 15(1), 14689. https://doi.org/10.1038/s41598-025-98878-0
3. Aebi, H. (1984). Catalase in vitro. In Methods in Enzymology, Academic Press, Vol. 105, pp. 121–126.
4. Anonymous, 2024. Global Assessment of Salt-Affected Soils. Available online at: https://www.fao.org/newsroom/detail/fao-launches-first-major-global-assessment-of-salt-affected-soils-in-50-years (Accessed July 7, 2025).
5. Al-Saif, A. M., Abdrabboh, G. A., Abdel-Aziz, H. F., Abd, A., Elnaggar, I. A., Abd El-Wahed, N. A. E. W., Sharaf, A., & Hamdy, A. E. (2023). Uncovering of some citrus rootstocks to salt stress tolerance in vitro screening [Preprint]. https://doi.org/10.20944/preprints202307.1216.v1
6. Asins, M. J., Raga, M. V., Romero-Aranda, M. R., Jaime-Fernández, E., Carbonell, E. A., & Belver, A. (2025). Salt Tolerance Diversity in Citrus Rootstocks Agrees with Genotypic Diversity at the LCl-6 Quantitative Trait Locus. Genes, 16(6), 683. https://doi.org/10.3390/genes16060683
7. Balasubramaniam, T., Shen, G., Esmaeili, N., & Zhang, H. (2023). Plants’ response mechanisms to salinity stress. Plants, 12(12), 2253. https://doi.org/10.3390/plants12122253
8. Bates, L. S., Waldren, R. P. A., & Teare, I. D. (1973). Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39(1), 205-207.

9. Beauchamp, C., & Fridovich, I. (1971). Superoxide dismutase: Improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Analytical Biochemistry, 44(1), 276–287. https://doi.org/10.1016/0003-2697(71)90370-8
10. Ben Rejeb, K., Lefebvre‐De Vos, D., Le Disquet, I., Leprince, A. S., Bordenave, M., Maldiney, R., ... & Savouré, A. (2015). Hydrogen peroxide produced by NADPH oxidases increases proline accumulation during salt or mannitol stress in A rabidopsis thaliana. New Phytologist, 208(4), 1138-1148. https://doi.org/10.1111/nph.13550
11. Bonnin, M., Favreau, B., Soriano, A., Leonhardt, N., Oustric, J., Lourkisti, R., ... & Santini, J. (2023). Insight into physiological and biochemical determinants of salt stress tolerance in tetraploid Citrus. Antioxidants, 12(8), 1640. https://doi.org/10.3390/antiox12081640
12. Chance, B., & Maehly, A. C. (1955). Assay of catalases and peroxidases. In S. P. Colowick & N. O. Kaplan (Eds.), Methods in Enzymology (Vol. 2, pp. 764–775). Academic Press. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(55)02300-8
13. Eskimez, İ., & Polat, M. (2023). Aronya (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott)’nın mikroçoğaltımında bitki büyüme düzenleyicilerinin etkileri. Meyve Bilimi, 10(Özel Sayı), 92-99. https://doi.org/10.51532/meyve. 1189817
14. Giannopolitis, C. N., & Ries, S. K. (1977). Superoxide dismutases: I. Occurrence in higher plants. Plant Physiology, 59(2), 309-314. https://doi.org/10.1104/pp.59.2.309
15. Gill, S. S., & Tuteja, N. (2010). Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48(12), 909-930. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2010.08.016
16. Hurrah, I. M., Mohiuddin, T., Mandal, S., Kumar, V., & Gupta, A. (2025). Crosstalk and interaction among salt stress tolerance pathways. In Exogenous Priming and Engineering of Plant Metabolic and Regulatory Genes (pp. 513-529). Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-443-13490-6.00031-X
17. Kalal, P., Manisha, D. V. V., Mahawer, A. K., Sachin, A. J., & Vs, K. N. (2023). Impact of salinity stress on citrus production and its alleviation strategies. The Pharma Innovation Journal, 12(6), 3620-3626.
18. Khoshbakht, D., Ramin, A. A., & Baninasab, B. (2014). Citrus rootstocks response to salinity: Physio-biochemical parameters changes. Research Journal of Environmental Sciences, 8(1), 29. https://doi.org/10.3923/rjes.2014.29.38
19. Miller, G. A. D., Suzuki, N., Ciftci‐Yilmaz, S., & Mittler, R. O. N. (2010). Reactive oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity stresses. Plant, Cell & Environment, 33(4), 453-467. https://doi.org/10.1111/j.1365-3040.2009.02041.x
20. Munns, R., & Tester, M. (2008). Mechanisms of salinity tolerance. Annu. Rev. Plant Biol., 59(1), 651-681. https://doi.org/10.1146/annurev.arplant.59.032607.092911
21. Ondrasek, G., Rathod, S., Manohara, K. K., Gireesh, C., Anantha, M. S., Sakhare, A. S., ... & Horvatinec, J. (2022). Salt stress in plants and mitigation approaches. Plants, 11(6), 717. https://doi.org/10.3390/plants11060717
22. Sajid, M., Ahsanullah, B. A., Ullah, I., Shah, S., Haleema, B., Nawab, K., ... & Muhammad, M. (2020). Screening of citrus rootstocks for salinity tolerance based on initial growth attributes and leaves proline content. Elementary Education Online, 19, 3128-3140. https://doi.org/10.17051/ilkonline.2020.04.764688
23. Shokri, N., Hassani, A., & Sahimi, M. (2024). Multi‐scale soil salinization dynamics from global to pore scale: A review. Reviews of Geophysics, 62(4), e2023RG000804. https://doi.org/10.1029/2023RG000804
24. Snoussi, H., Askri, H., Nacouzi, D., Ouerghui, I., Ananga, A., Najar, A., & El Kayal, W. (2022). Comparative transcriptome profiling of salinity-induced genes in citrus rootstocks with contrasted salt tolerance. Agriculture, 12(3), 350. https://doi.org/10.3390/agriculture12030350
25. Syvertsen, J. P., & Garcia-Sanchez, F. (2014). Multiple abiotic stresses occurring with salinity stress in citrus. Environmental and Experimental Botany, 103, 128-137. https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2013.09.015
26. Wu, Q. S., Zou, Y. N., Liu, W., Ye, X. F., Zai, H. F., & Zhao, L. J. (2010). Alleviation of salt stress in citrus seedlings inoculated with mycorrhiza: Changes in leaf antioxidant defense systems. Plant, Soil and Environment, 56(10), 470–475.
27. Zar, J. H. (2013). Biostatistical Analysis. Pearson Higher Ed, UK.
28. Zhang, H., Yu, C., Zhang, Q., Qiu, Z., Zhang, X., Hou, Y., & Zang, J. (2025). Salinity survival: Molecular mechanisms and adaptive strategies in plants. Frontiers in Plant Science, 16, 1527952. https://doi.org/10.3389/fpls.2025.1527952
29. Zhang, M., Li, X., Wang, X., Feng, J., & Zhu, S. (2023). Potassium fulvic acid alleviates salt stress of citrus by regulating rhizosphere microbial community, osmotic substances and enzyme activities. Frontiers in Plant Science, 14, 1161469. https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1161469