The Comparative Analysis of Some DNA Isolation Methods in Various Plant Taxa

Abstract

Molecular biology studies in plants require high quality DNA isolation from the taxa studied. Therefore, DNA isolation with high concentration and as pure as possible from plants to be used in studies is extremely important. There are different protocols for genomic DNA isolation from plants. In this study, some taxa belonging to Asteraceae, Apiaceae and Lamiaceae families of medicinal and aromatic plants were used. It has been tried to investigate which types of tissues are more effective by taking samples from both dry leaf tissues of taxa that have been turned into herbarium material and fresh leaf tissues. In the methods used, only CTAB and CTAB + PVP were prepared together in extraction buffer solutions, in addition to this, a ready-made isolation kit was used. In general, high concentrations of DNA were obtained from all methods, while the amount of proteins, RNA, polysaccharides, essential oils, phenols and other contaminants in the gDNA obtained by these methods were tried to be minimized. While the concentration and purity of the isolated DNA was measured in a nanodrop spectrophotometer, its density was visualized in agarose gel electrophoresis. In addition, the suitability of the obtained DNAs for PCR studies was tested using various primers. Although the amount and quality of the obtained DNA varies between taxa, the best quality isolation has always been obtained from isolations using fresh plant material. However, the extraction method using only CTAB solution provided DNA with the highest purity and density. Following this, it was observed that CTAB + PVP methods gave similar results, while the use of ready-made kits was not very useful in DNA isolation from plants. Although the use of ready-made kits gives clearer looking DNA, the obtained DNA was found to be insufficient and did not give positive results in PCR studies.

Keywords

• DNA isolation
• Plant
• CTAB
• PCR

Çeşitli Bitki Taksonlarında Bazı DNA İzolasyon Yöntemlerinin Karşılaştırmalı Analizi

Öz

Bitkilerde moleküler düzeyde yapılan çalışmalar, incelenen taksonlardan maksimum kalitede DNA eldesi gerektirmektedir. Bu nedenle, çalışılacak bitkilerden yüksek konsantrasyonlu ve mümkün olabildiğince saf DNA eldesi son derece önemlidir. Bitkilerden genomik DNA izolasyonu için farklı protokoller bulunmaktadır. Bu araştırmada tıbbi ve aromatik bitkilerden Asteraceae, Apiaceae ve Lamiaceae familyalarına ait bazı taksonlar kullanılmıştır. Taksonların hem herbaryum materyali haline getirilmiş kuru yaprak dokularından, hemde taze yaprak dokularından örnekler alınarak denenecek yöntemlerin hangi tip dokularda daha etkin olduğu araştırılmaya çalışılmıştır. Kullanılan yöntemlerde ekstraksiyon tampon çözeltileri içinde yalnızca CTAB ile CTAB+PVP beraber olacak şekilde hazırlanmış, buna ilave olarak hazır izolasyon kiti kullanılmıştır. Genel olarak tüm yöntemlerden yüksek konsantrasyonda DNA elde edilirken, bu yöntemlerle elde edilen gDNA’da, proteinler, RNA, polisakkaritler, uçucu yağlar, fenoller ve diğer kirleticilerin miktarı minimal düzeye indirilmeye çalışılmıştır. İzole edilen DNA’ların konsantrasyonu ve saflığı nanodrop spektrofotometrede ölçülürken, yoğunluğu agaroz jel elektroforezinde görüntülenmiştir. Ayrıca elde edilen DNA’ların PCR çalışmalarına uygunluğu da çeşitli primerler kullanılarak test edilmiştir. Elde edilen DNA’ların miktarı ve kalitesi taksonlar arasında farklılık gösterse de en kaliteli izolasyon her zaman taze bitki materyali kullanılarak yapılan izolasyonlardan elde edilmiştir. Bununla birlikte yalnızca CTAB çözeltisi kullanılan ekstraksiyon yöntemi en yüksek saflık ve yoğunlukta olan DNA’ yı sağlamıştır. Bunu takiben CTAB+PVP yöntemlerinin benzer sonuçlar verdiği görülürken, hazır kit kullanımının ise bitkilerden DNA izolasyonunda çok da kullanışlı olmadığı saptanmıştır. Hazır kit kullanımı her ne kadar daha temiz görünümlü DNA verse de elde edilen DNA’ların yetersiz olduğu görülmüş ve PCR çalışmalarında müspet sonuç vermemiştir.

Anahtar Kelimeler

• DNA izolasyonu
• Bitki
• CTAB
• PCR

Kaynakça

1. Aydın, S. Ö., Köçkar, F. (2008). Farklı genomik dna izolasyon yöntemlerinin Satureja (Labiatae) türlerinde uygulanması. Balıkesir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 1:52-60.
2. Bozkaya, F. (2012). DNA İzolasyonunda Fenol-Kloroform Yerine Potasyum Asetat Kullanımının DNA Miktarı ve Kalitesi Üzerine Etkisi. Harran Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 1/2:92-96.
3. Christensen, L. P., Brandt, K. (2006). Bioactivite Polyacetylenes in Food Plants of the Apiaceae Family Occurence. Bioctivity and Analysis, 41, 683-689.
4. Demirpolat, A. (2017). Türkiye'de Yetişen Bazı Scandıx L. (Apiaceae) Türleri Üzerinde Biyosistematik Araştırmalar. Doktora Tezi, Fırat Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Elazığ.
5. Doğan, B., (2007). Türkiye Jurinea Cass. (Asteraceae) cinsinin revizyonu. Doktora Tezi, Selçuk Üniversitesi, Biyoloji Anabilim Dalı, Konya.
6. Doğan, G. (2013). Hyperıcum L. (Hyperıcaceae) Cinsine Ait Drosanthe (Spach) Endl. Eksiyonunun Kloroplast Genomunun Kodlanmayan “Trn” Bölgelerine Göre Karşılaştırmalı Filogenetik Analizi. Doktora Tezi, Fırat Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Elazığ.
7. Doyle, J. J., Doyle, J. L., (1987). A Rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemistry Bull, 19, 11-15.
8. Duke, J. A. (1987). Handbook of Medicanal Plants. Boca Raton, Florida, CRC Press.

9. Ergül, A. (2000). Asmalarda (Vitis vinifera L. cvs.) genomic DNA Parmak İzi Analizi ile Moleküler Karakterizasyon. Doktora Tezi, Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara.
10. Güner, A., Aslan, S., Ekim, T., Vural, M., Babaç, M. T. (edtr), (2012). Türkiye Bitkileri Listesi (Damarli Bitkiler). Nezahat Gökyiğit Botanik Bahçesi ve Flora Araştırmaları derneği Yayını, İstanbul.
11. Hoisington, D. (1992). Laboratory protocols, CIMMYT. Applied Molecular Genetics Laboratory, Mexico DF.
12. Kabaoğlu, A. (2007). Türkiye’de bulunan Hypogymnia (Nyl.) Nyl. Türlerinde rDNA ITS Bölgesi Dizi Analizi ile Çeşitliliğin Tanımlanması. Yüksek Lisans Tezi, Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara.
13. Karataş, A., Ağaoğlu, Y. S. (2006). Güneydoğu Anadolu Bölgesi üzüm çesitlerine ait DNA’ların miktar ve saflıkları üzerine bir araştırma. Harran Üniversitesi Ziraat Fakültesi dergisi, 10:83-90.
14. Kaya, A. (1997). Türkiye’de Yetişen Acinos Miller Türleri Üzerinde Morfolojik Anotomik Ve Kimyasal Araştırmalar. Doktora Tezi, Anadolu Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Eskşehir.
15. Kurşat, M. (2010). Türkiye’de Yetişen Artemisia L. (Asteraceae) Taksonlarının Taksonomik Revizyonu. Doktora Tezi, Fırat Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Elazığ.
16. Porebski, S., Bailey, L. G., Baum, B. R. (1997). Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Molecular Biology Report, 15, 8–15.
17. Sancar, P. Y. (2017). Türkiye’de yetişen Anthrıscus Pers. (Apiaceae) Türlerinin Genetik Yapısının ve Filogenetik Akrabalık İlişkilerinin Kloroplast Genomunun Kodlanmayan “trn” Bölgelerine Göre Araştırılması. Doktora Tezi, Fırat Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Elazığ.
18. Sevindik, E., Coşkun, F., Çetiner, N. G., Selvi, S., Şahin, N. (2013). The genomic DNA isolation methods comparative analysis upon some Sideritis (Labiateae) and Serratula (Asteraceae) taxa. Biological Diversity and Conservation, 6/2, 16-21.