Bacillus pumilus NK14 İzolatının Proteaz Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi ve Enzimin Leke Çıkarıcı Etkisinin Tespiti

Öz

Proteaz enzimi deri, gıda, tekstil, deterjan ve ilaç sanayisi gibi pek çok alanda yaygın olarak kullanılmaktadır. Özellikle termofilik bakterilerden elde edilen alkalin proteaz enzimleri uzun raf ömürleri, yüksek katalitik aktiviteleri ve stabiliteleri nedeniyle oldukça ilgi çekmektedir. Bu bağlamda yapılan çalışmada Erzurum sıcak su kaynaklarından bakteriyel izolasyonlar yapılarak bu izolatların proteaz enzim aktiviteleri analiz edildi. İzolatlar; Gram boyama, endospor, katalaz, oksidaz, proteaz, lipaz ve amilaz testlerine tabi tutuldu. Bu amaçla izolatlar öncelikle %10 Skim Milk içeren besiyerlerinde inkübasyona bırakılarak proteaz enzim aktiviteleri tespit edildi. Besiyerlerinde proteolitik zon oluşturan izolatlar 16S rRNA dizi analiziyle tür seviyesinde tanılandı. En yüksek
proteolik zon oluşturan Bacillus pumilus NK14 izolatının kültür süpernatantından elde edilen proteaz enziminin aktivite testi yapıldı (91,17 EU/ml) ve birtakım parametrelerin bu enzim aktivitesi üzerine etkileri tespit edildi. B. pumilus NK14 izolatının optimum enzim aktivitesini 50°C’de pH 10’da gösterdiği, sıcaklık ve pH stabilite testleri sonucunda 40°C’de ve pH 8’de kararlı yapıda olduğu gözlendi. Enzimin PMSF ile büyük bir oranda inhibe olduğu (%17), EDTA, EGTA, SDS ve üre ile de aktivitesinin azaldığı (%75, %80, %65, %88) belirlendi. Tween 20 (%108) ve Tween 80 (%115) ile muamele sonucunda enzim aktivitesinde artış olduğu, Ca+2, Mg+2 ve Mn+2 divalent metal iyonlarıyla enzim aktivitesinin sırasıyla %110, %112, %125 oranında arttığı, buna karşın Zn+2 ve Cu+2 ile de %86 ile %78 oranında azaldığı tespit edildi. İzolata ait Lineweaver-Burk grafiği çizilerek Km ve Vmax değerleri hesaplandı (0,673 mg/ml-99 EU/ml). B. pumilus NK14 izolatının kültür süpernatantından elde edilen proteaz enziminin deterjan sanayi uygulamalarında kullanılabilirliğini test etmek amacıyla kan lekesi bulaştırılmış kumaş parçaları üzerinde leke çıkarıcı etkisi test edilerek sonuçların oldukça etkili olduğu tespit edildi.

Anahtar Kelimeler

• termofil
• proteaz
• Bacillus pumilus
• 16S rRNA
• deterjan sanayi

Determination of Protease Enzyme Activity of Bacillus pumilus NK14 Isolate and Detection of the Stain Removal Effect of the Enzyme

Öz

Protease enzyme is widely used in food, textile, detergent and pharmaceutical industries. Especially alkaline protease enzymes obtained from thermophilic bacteria are of great interest due to their long shelf life, high catalytic activity and stability. In this study, bacterial isolations were made from Erzurum hot water sources and the protease enzyme activities of these isolates were analyzed. Isolates; Gram staining, endospores, catalase, oxidase, protease, lipase and amylase tests were performed. Isolates were firstly incubated in 10% Skim Milk medium and the protease enzyme activities were determined. Isolates were identified at species level by 16S rRNA analysis. The activity of the protease enzyme obtained from the culture supernatant of the highest proteolytic zone Bacillus pumilus NK14 was tested (91,17 EU/ml) and the effects of some parameters on this enzyme activity were determined. The B. pumilus NK14 isolate showed optimum enzyme activity at pH 10 at 50°C. It was stable at 40°C and pH 8. The enzyme was significantly inhibited by PMSF (17%), and its activity was reduced by EDTA, EGTA, SDS and urea (75%, 80%, 65%, 88%). Tween 20 (108%) and Tween 80 (115%) as a result of treatment with an increase in enzyme activity, Ca⁺², Mg⁺² and Mn⁺² with divalent metal ions in the enzyme activity increased by 110%, 112%, 125%, while Zn⁺² and Cu⁺² decreased by 86% and 78%. The Lineweaver-Burk plot of the isolate was plotted and the Km and Vmax values​were calculated (0.673 mg/ml-99 EU/ml). In order to test the usability of the protease enzyme obtained from the culture supernatant of the B. pumilus NK14 isolate in detergent industry applications, the stain removal effect on blood stain contaminated fabric pieces was tested and the results were found to be highly effective.

Anahtar Kelimeler

• thermophile
• protease
• B. pumilus
• 16S rRNA

Kaynakça

1. KAYNAKLAR[1]Adiguzel, A., Nadaroglu, H., Adiguzel, G. (2015) Purification and Characterisation of β-mannanase from Bacillus pumilus (M27) and Its Applications in Some Fruit Juices. Journal of Food Science and Technology. https://doi.org/10.1007/s13197-014-1609-y
2. [2]Alpan, L. G. (2008) Bazı Ekstrem Termofil Anaerobik Bakterilerin Alkali Proteazlarının Özelliklerinin Belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara Üniversitesi, Ankara.
3. [3]Çevik, S., (2010) Ege Bölgesi Sıcak Su Kaynakları ve Toprak Örneklerinden İzole Edilen Termofilik Aktinomisetlerin Proteaz Üretimlerinin Karakterizasyonu. Yüksek Lisans Tezi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Ege Üniversitesi, Bornova İzmir.
4. [4]Dülger, S., (1997) Ayder Kaplıcasından Termofilik Bakteri İzolasyonu ve Teşhisi. Yüksek Lisans Tezi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Karadeniz Teknik Üniersitesi, Trabzon.
5. [5]El-Gendi, S.M., Helal, S.F., Nagem, S.A. (2016) Mismatch repair protein expression status in Egyptian colorectal carcinoma: a single-centre study. Egyptian Journal of Pathology. 36(2), pp.185-193., https://doi.org/10.1097/01.XEJ.0000504540.12465.b7
6. [6]Görmez, (2011) Erzurum İli’nde Kayısı Ağaçlarından İzole Edilen Pseudomonas Türlerinin Tanısı, Karakterizasyonu Ve Çeşit Reaksiyonları. Doktora Tezi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Atatürk Üniversitesi, Erzurum
7. [7]Güder, S., (2014) Scytalidium thermophilum Ksilanazının Kromatografik Yöntemlerle Saflaştırılması ve Biyokimyasal Karakterizasyonu. Yüksek lisans tezi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Karamanoğlu Mehmetbey Üniversitesi, Karaman.
8. [8]Hameş-Kocabaş, E. E., Uçar, F., Ersin, N. K., Uzel, A., Alpöz, A. R. (2008). Colonization and vertical transmission of Streptococcus mutans in Turkish children. Microbiological research. 163(2), 168-172., https://doi.org/10.1016/j.micres.2006.03.016

9. [9]Hammami, A., Hamdi, M., Abdelhedi, O., Jridi, M., Nasri, M., Bayoudh, A. (2017) Surfactant-and oxidant-stable alkaline proteases from Bacillus invictae: Characterization and potential applications in chitin extraction and as a detergent additive. International journal of biological macromolecules. 96, 272-281., https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2016.12.035
10. [10]Harley, J.P. and Prescott, L.M. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology 4th Edition. The McGraw-Hill Companies: New York.
11. [11]Hussain, F., Kamal, S., Rehman, S., Azeem, M., Bibi, I., Ahmed, T., Iqbal, H. M. 2017. Alkaline Protease Production Using Response Surface Methodology, Characterization and Industrial Exploitation of Alkaline Protease of Bacillus subtilis sp. Catalysis Letters,147(5), 1204-1213., https://doi.org/10.1007/s10562-017-2017-5
12. [12]Jiménez-Moreno, E., Frikha, M., de Coca-Sinova, A., Lázaro, R. P., Mateos, G. G. (2013) Oat hulls and sugar beet pulp in diets for broilers. 2. Effects on the development of the gastrointestinal tract and on the structure of the jejunal mucosa. Animal feed science and technology.182(1-4), 44-52., https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2013.03.012
13. [13]Klement, Z., Rudolph, K. and Sands, D.C., (1990) Methods in Phytopathology. Akademiai Kiado, 153-180, Budapest.
14. [14]Kumar, C.G., Takagi, H., (1999) Microbial Alkaline Proteases: From A Bioindustrial Viewpoint. Biotechnol Advances 17: 561-594., https://doi.org/10.1016/S0734-9750(99)00027-0
15. [15]Lazo, G. R., Roffey, R., Gabriel, D. W. (1987). Pathovars of Xanthomonas campestris are distinguishable by restriction fragment-length polymorphism. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 37(3), 214-221., https://doi.org/10.1099/00207713-37-3-214
16. [16]Lineweaver, H., Burk, D., (1934) The determination of enzyme dissocation constants. J. Am. Chem. Soc. 57, 685 1934. https://doi.org/10.1021/ja01318a036
17. [17]Marathe, S. K., Vashistht, M. A., Prashanth, A., Parveen, N., Chakraborty, S., Nair, S. S. (2017) Isolation, partial purification, biochemical characterization and detergent compatibility of alkaline protease produced by Bacillus subtilis, Alcaligenes faecalis and Pseudomonas aeruginosa obtained from sea water samples. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. https://doi.org/10.1016/j.jgeb.2017.10.001
18. [18]Matpan, F., (2007) Diyadin (Ağrı) Sıcak Su Kaynaklarından Bakteri İzolasyonu ve Bazı Enzimleri Üzerinde Çalışmalar. Fen Bilimleri Enstitüsü, Dicle Üniversitesi, Diyarbakır
19. [19]Önal, S., (2010) Enzimler, Bölüm 8. Moleküler biyoloji, Yıldırım, A., Bardakçı, F., Karataş, M., Tanyolaç, B. Ankara, 249-296.
20. [20]Pan J, Huang Q, Zhang Y. Gene cloning and expression of an alkaline serine protease with dehairing function from Bacillus pumilus. Current microbiology. 2004;49(3):165-9. Accessed April 11, 2012., https://doi.org/10.1007/s00284-004-4305-8
21. [21]Pant, G., Prakash, A., Pavani, J. V. P., Bera, S., Deviram, G. V. N. S., Kumar, A., Prasuna, R. G. (2015) Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis. Journal of Taibah University for Science. 9(1), 50-55., https://doi.org/10.1016/j.jtusci.2014.04.010
22. [22]Pirinççioğlu, H., (2010) Dargeçit ve Güçlükonak Sıcak Su Kaynaklarından Termofilik Bakteri İzolasyonu ve Tanımlanması. Yüksek Lisans Tezi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Dicle Üniversitesi, Diyarbakır.
23. [23]Raval, V.H., Pillai, S., Rawal, C.M. and Singh, S.P., (2014) Biochemical and structural characterization of a detergent-stable serine alkaline protease from seawater haloalkaliphilic bacteria. Process Biochemistry. 49(6), pp.955-962., https://doi.org/10.1016/j.procbio.2014.03.014
24. [24]Sarı, E., (2011) Bacillus circulans M34’ten Proteaz Enziminin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu. Yüksek Lisans Tezi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, Ankara Üniversitesi, Ankara.
25. [25]Saygılı, H., (1995) Fitobakteriyoloji. Ege Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Bölümü, 203, Bornova-İzmir.
26. [26]Seiler, H., Wenning, M., Schmidt, V., Scherer, S. (2013) Bacillus gottheilii sp. nov., isolated from a pharmaceutical manufacturing site. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 63(3), 867-872. https://doi.org/10.1099/ijs.0.036277-0
27. [27]Tamer, A.Ü., Uçar, F., Ünver, E., Karaboz, İ., Bursalıoğlı. M., Oğultekin. R. (1989) 3-4 Sınıf Laboratuvar Klavuzu, Anadolu Üniversitesi, Eskişehir, 81-90.
28. [28]Tarakçıoğlu, S., (2016) Erzurum Ilıca Kaplıcalarından Alınan Su Örneklerinden Termofilik Bakterilerin İzolasyonu, İdentifikasyonu ve Bacillus thermoamylovorans ST10 İzolatından Lipaz Enziminin Saflaştırılması, Karakterizasyonu. Yüksek Lisans Tezi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Atatürk Üniversitesi, Erzurum.
29. [29]Tekin, N., (2008) Türkiye Kaynaklı Bacillus Sp.’lerin Alkalen Proteaz Üretim Kapasiteleri ve Enzimlerin Kısmen Karakterizasyonu. Yüksek Lisans Tezi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara Üniversitesi. Ankara.
30. [30]Thumar, J.T., Singh, S.P. (2007) Secretion of an alkaline protease from a salt-tolerant and alkaliphilic, Streptomyces clavuligerus strain MIT-1. Brazilian journal of Microbiology. 38(4), pp.766-772., http://dx.doi.org/10.1590/S1517-83822007000400033
31. [31]Vaz-Moreira, I., Figueira, V., Lopes, A. R., Lobo-da-Cunha, A., Spröer, C., Schumann, P., Manaia, C. M. (2012) Bacillus purgationiresistans sp. nov., isolated from a drinking-water treatment plant. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 62(1), 71-77., https://doi.org/10.1099/ijs.0.028605-0
32. [32]Vijayaraghavan, P., Lazarus, S., Vincent, S.G.P. (2014) De-hairing protease production by an isolated Bacillus cereus strain AT under solid-state fermentation using cow dung: Biosynthesis and properties. Saudi journal of biological sciences. 21(1), pp.27-34., https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2013.04.010
33. [33]Yilmaz, B., Baltaci, M. O., Sisecioglu, M., Adiguzel, A. (2015) Thermotolerant alkaline protease enzyme from Bacillus licheniformis A10: purification, characterization, effects of surfactants and organic solvents. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry. 31(6), 1241-1247., https://doi.org/10.3109/14756366.2015.1118687