Hücre hatlarını oluşturmakta kullanılan plasmidlerin genomik lokasyonları?

Öz

Hücre hatlarını oluşturma yollarından biri, hücreleri DNA tümör virüsleri ile enfekte etmektir.  İmmortalizasyon işleminde kullanılan vektör DNA dizileri, genomik DNA'ya entegre halde bulunurlar. Bu çalışmada, söz konusu vektörlere ait DNA parçalarının binlerce pasaj sonrası durumları K562 hücre hattında sorgulanmıştır. Yapılan çalışmada, DNA parçalarını yakalama (sequence capture array) metodu ile yeni nesil dizileme teknolojisi birleştirilerek genoma entegrasyon bölgeleri tespit edilmiştir. K562 hücrelerinde, hücre soyunun immortalizasyonunda kullanılan viral DNA dizileri ile eşleşen 15540 fragman elde edilmiştir. Bu fragmanların %60'ının immortalizasyonda kullanıldığı bilinen Simian virus 40 T antijenine, %12'sinin pGNS-BAC klonlama vektörüne, %11'inin FBDki knock-in vektörüne, %11'inin pSTH1-GFP DNA klonlama vektörüne ve %6'sının insan herpes virüs 5 strain Toledo'ya, ait olduğu görülmüştür. Ayrıca, SV-40'ın 3q1.2 kromozomal bölgesindeki TBC genine entegre halde bulunduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak, K562 hücre soyunun immortalizasyonunda kullanılan vektör profili çıkarılmış ve SV-40 T antijenin bu hücredeki entegrasyon bölgesi tespit edilmiştir.

Anahtar Kelimeler

• -

Kaynakça

1. Hyun Min Jung, Seong-Jun Choi, Jin Kyeoung Kim. Expression profiles of SV40-immortalization-associated genes upregulated in various human cancers. Journal of cellular biochemistry. 2009;106(4): 703-13
2. Shay, J.W., Wright, W.E., & Werbin, H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization. Biochim BiophysActa. 1991;1072: 1-7
3. Hammerschmidt,W. and Sugden,B. Genetic analysis of immortalizing functions of Epstein-Barr virus in human B lymphocytes. Nature. 1989; 340:393-397.
4. Ozer HL, Banga SS, Dasgupta T, Houghton J, Hubbard K, Jha KK, Kim SH, Lenahan M , Pang Z, Pardinas JR, Patsalis PC. SV40-mediated immortalization of human fibroblasts. Exp Gerontol. 1996;31:303-310.
5. Shiga T, ShirasawaH, ShimizuK,DezawaM,Masuda Y, Simizu B. Normal human fibroblasts immortalized by introduction of human papillomavirus type 16 (HPV-16) E6- E7 genes. Microbiol Immunol. 1997;41:313-319.
6. Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 1977;36 (l):59-74.
7. Gama-Norton L, Botezatu L, Herrmann S, Schweizer M , Alves PM, Hauser H, Wirth D. Lentivirus Production Is Influenced by SV40 Large T-Antigen and Chromosomal Integration of the Vector in HEK293 Cells. Hum Gene Ther. 2011;22(10):1269-79
8. Wang GP, Garrigue A, Ciuffi A, Ronen K, Leipzig J, Berry C, Lagresle-Peyrou C, Benjelloun F, Hacein-Bey-Abina S, Fischer A, Cavazzana-Calvo M, and Bushman FD. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer Nucleic Acids Research. 2008;36(9):e49

9. Gabriel R, Eckenberg R, Paruzynski A, Bartholomae CC, Nowrouzi A, Arens A, Howe SJ, Recchia A, Cattoglio C, Wang W, Faber K, Schwarzwaelder K, Kirsten R, Deichmann A, Ball CR, Balaggan KS, Yänez-Munoz RJ, Ali RR, Gaspar HB, Biasco L, Aiuti A, Cesana D, Montini E, Naldini L, Cohen- Haguenauer O, Mavilio F, Thrasher AJ, Glimm H, von Kalle C, Saurin W, Schmidt M. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 2009;15(12):1431-1436.
10. Okou DT, Locke AE, Steinberg KM, Hagen K, Athri P, Shetty AC, Patel V, Zwick ME Combining microarray-based genomic selection (MGS) with the Illumina Genome Analyzer platform to sequence diploid target regions. Ann Hum Genet. 2009Sep;73(Pt5):502-13.
11. Duncavage EJ, Magrini V, Becker N, Armstrong JR, Demeter RT, Wylie T, Abel HJ, Pfeifer JD. Hybrid capture and next-generation sequencing identify viral integration sites from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue J Mol Diagn. 2011;13(3):325-33.
12. Johansson H, Isaksson M , Sörqvist EF, Roos F, Stenberg J, Sjöblom T, Botling J, Micke P, Edlund K, Fredriksson S, Kultima HG, Ericsson O, Nilsson M. Targeted resequencing of candidate genes using selector probes. Nucleic Acids Res. 2011;39(2):e8.
13. Bryan TM, Reddel RR. SV40-induced immortalization of human cells. Crit Rev Oncol. 1994;5: 331-357.
14. Liu J, Kaur G, Zhawar VK, Zimonjic DB, Popescu NC, Kandpal RP, and Athwal RS. Role of SV40 Integration Site at Chromosomal Interval lq21.1 in Immortalized CRL2504 Cells. Cancer Res. 2009;69:7819-7825
15. Chang TH, Ray FA, Thompson DA, Schlegel R. Disregulation of mitotic checkpoints and regulatory proteins following acute expression of SV40 large T antigen in diploid human cells. Oncogene 1997;14: 2383-2393.