β-katerin ve Axin2 proteinleri etkileşimlerinin "Proksimiti Ligasyon Assay (Yakınsal Bağlanma Tespiti)" ile görüntülenmesi

Yıl 2011, Cilt: 1 Sayı: 2, 24 - 27, 30.12.2011

Yücel Erbilgin Özden Hatırnaz Müge Sayitoğlu , Ola Söderberg Uğur Özbek

Öz

Amaç: Sinyal yolakları ve proteinlerin fonksiyonel olarak derinlemesine çalışılmasının gerekliliği nedeni ile, proteomiks
çalışmalarında protein-protein etkileşimlerinin analizi her geçen gün daha da önemli hale gelmektedir. Proksimiti ligasyon assay
(PLA), hücre ve doku kesitlerinde hücre içi proteinlerin ve protein interaksiyonlanmn keşfedilmesi amacı ile kullanılan yeni
bir yöntemdir. Bu çalışmada, PLA yöntemini kullanarak, WNT sinyal ileti yolağı proteinlerinden aktive β-katenin ve Axin2
proteinlerinin etkileşimlerini bir T-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) hücre hattı olan Jurkat hücrelerinde göstermeyi
amaçladık.
Gereç ve Yöntem: Jurkat hücreleri RPMT lı besi yerinde yetiştirilip lamlara fikse edilir. Geçirgen hale getirilen hücreler blokaj
aşamasından ardından birincil antikorlar ve PLA problan ile muamele edilirler. Hibridizasyon ve ligasyonunun ardından sirküle
oligonükleotidler, sirküle dönen amplifikasyon (RCA) için substrat oluştururlar. RCA ürünleri Texas Red işaretli probların
hibridizasyonu ile işaretlenir ve in situ PLA sinyalleri floresan mikroskobunda görüntülenir.
Bulgular: Öncelikle hücre içi β-katenin and Axin2 protein ekspresyonlan belirlendi. Ardından aktive β-katenin-Axin2 protein
interaksiyon varlığı hem nükleus hem de sitoplazmada gösterildi.
Sonuç: Burada sunulan sonuçlar, in situ PLA tekniğinin, WNT yolağı üyelerinin birbirleri ile olan etkileşimlerinin hücresel
boyutta tespit edilmesinde kullanılabileceğini göstermiştir. Çalışmamızda, aktive β-katenin-Axin2 protein etkileşimini T-ALL
hücre soyunda (Jurkat) gösterdik. Bu WNT sinyal yolağının T-ALL de bozulmuş regülasyonuna işaret ettiğini göz önünde
bulundurursak WNT yolağı elemanları yeni tedavi protokolleri için birer hedef molekül halini alabilirler.