Akut bruselloz tanısında polimeraz Zincir Reaksiyonu yöntemininin kullanımı

Öz

Amaç: Bruselloz, pek çok ülkede olduğu gibi ülkemiz için de önemli bir halk sağlığı sorunu olan zoonozdur. Özgül olmayan şikayetler ve bulgularla seyreden hastalığın tanısında altın standart olan kültürde bakteriyi üretmek oldukça zor ve zaman alıcıdır. Rutinde daha sık kullanılan serolojik yöntemlerin çapraz reaksiyonlardan dolayı özgüllüğü düşüktür. Polimeraz zincir reaksiyonu PZR gibi moleküler yöntemler pek çok enfeksiyon hastalığı gibi brusellozun erken ve hızlı tanısında iyi bir alternatif yöntemdir. Bu çalışmada, bruselloz tanısında PZR yönteminin konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırılması amaçlandı. Yöntemler: Çalışma grubu bruselloz ön tanılı 35 hasta ve 20 sağlıklı gönüllüden oluşturuldu. Hasta ve kontrol grubundan serolojik çalışma için serum, PZR için tam kan alınırken, hastalardan ateşli oldukları dönemde kan kültürleri alındı. Tam kan örneklerinden elde edilen lökosit pelletlerinden DNA izolasyonu yapıldı ve brusella DNA’ sı in house PZR yöntemiyle tespit edildi. Bulgular: Hastaların Standart tüp aglütinasyon SAT değeri 1 olguda 1/80 iken, diğerlerinde ≥1/160 idi. Bunların 16’sında kan kültürü pozitif bulundu. Kontrollerin SAT değerleri negatif idi. PZR yöntemiyle yapılan çalışmada hastaların %97’sinde pozitiflik saptanırken kontrollerin hepsi negatif bulundu. Sonuç: Kullanılan PZR yönteminin erken ve hızlı tanıda yüksek duyarlılıkta olduğu, bu nedenle bruselloz hızlı ve doğru tanısı için kullanılmasının uygun olacağı sonucuna varıldı.

Anahtar Kelimeler

• Bruselloz, tanı, PZR

Diagnosis of acute brucellosis by polymerase chain reaction technique

Öz

Objective: Brucellosis is a zoonotic disease which is a public health problem in our country like many parts of the world. The illness has nonspecific symptoms and physical signs. Bacterial culture is gold standard in the diagnosis of brucellosis but it is difficult and time consuming, so serologic techniques are used routinely. But serologic techniques have low specificity because of cross reactions. Molecular methods like polymerase chain reaction PCR are good alternatives in the early and rapid diagnosis of brucellosis, as it is in other infectious diseases. The aim of this study was to compare PCR method with conventional methods in the diagnosis of brucellosis. Methods: The study included 35 patients and 20 healthy volunteers. Sera for serology and whole blood samples for PCR were collected from each subject in both groups. DNA was extracted from peripheral mononuclear cells obtained from the blood samples and an in house PCR assay was used to detect brucella DNA. Results: Standart tube agglutination STA titers of most patients were ≥1/160, except one patient which was 1/80. Blood cultures were positive for 16 patients. The STA titers of all controls were negative. PCR was positive for 97% of the patients and all of the volunteers were negative. Conclusion: It is concluded that the tested PCR assay has high sensitivity in the diagnosis of brucellosis and it may be used in rapid and accurate diagnosis of brucellosis.

Anahtar Kelimeler

• Brucellosis, diagnosis, PCR

Kaynakça

1. 1. Young EJ, Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, eds. Principles and Practice of Infectious Diseases. 5th ed. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2005: 2669-73.
2. 2. Sözen TH. Bruselloz. İnfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi. Ed: Willke Topçu A, Söyletir G, Doğanay M. Nobel Tıp Kitabevleri, 2002; 636-42.
3. 3. Mehmet Uluğ, Nuray Can-Uluğ. Brusellozlu 78 Olgunun Değerlendirilmesi. Klimik Dergisi, 2010; 23(3): 89-94.
4. 4. Kılıç S, Babür C. Biyolojik silah olarak bakteriler “Kategori B ajanlar”. Türk Hij Den Biyol Derg 2006; 63: 47–66.
5. 5. Al Dahouk S, Tomaso H, Nöckler K, Neubauer H, Frangoulidis D. Laboratory-based diagnosis of brucellosis—a review of the literature. Part I: Techniques for direct detection and identification. Clin Lab, 2003; 49: 487–505.
6. 6. Kılıç S. Mikrobiyolojik Tanı. Türkiye Klinikleri J Inf Dis-Special Topics, 2012; 5 (1): 46-66.
7. 7. Kılıç S, Çelebi B, Bayram Y, Çitil B. Francisella tularensis antikorları ile çapraz reaksiyonlarının araştırılması. Turk Hij Den Biyol Derg, 2013; 70(2): 65–70.
8. 8. Kocabeyoğlu Ö. Brucella abortus, Brucella melitensis, Yersinia enterocolitica. Serotip 0:3 ve 0:9 Arasındaki Antijenik İlişkinin Araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni, 1990; 24(3): 218-25.

9. 9. Aktas. O. Brusellozda Mikrobiyolojik Tanı. ANKEM Derg, 2003; 17: 336-39.
10. 10. Al Dahouk S, Tamaso H, Nockler K, Neubauer H, Frangoulidis D. Laboratory-based diagnosis of brucellosis-A Review of literature. Part 2: Serological Tests for brucellosis. Clin Lab, 2003; 49: 577-89.
11. 11. Navarro E, Casao MA, Solera J. 2004. Diagnosis of human brucellosis using PCR. Expert Rev Mol Diagn, 4(1): 115-23.
12. 12. Navarro E, Segura JC, Castaño MJ, Solera J. Use of Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction to Monitor the Evolution of Brucella melitensis DNA Load During Therapy and Post-Therapy FollowUp in Patients with Brucellosis. Clin Infect Dis, 2006; 42 (9): 1266-73.
13. 13. Erdenliğ S. Türkiye’de Brucella kökenleri. Klimik Derg, 2003; 16: 214-6.
14. 14. Bilgehan H. Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Barış Yayınları Fakülteler Kitapevi. 4. Baskı. İzmir, 2000; 475-80.
15. 15. Fındık D. Bruselloz tanısında sorunlar. Klimik Kongre kitabı. 2005: 104-7.
16. 16. Bilgehan H. Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Barıs Yayınları Fakulteler Kitapevi. 4. Baskı. İzmir, 2000; 227-8.
17. 17. Badur S. Brusellozda Serolojik Tanı ve Seroepidemiyoloji. Klimik Derg, 1990; 3: 1-1720.
18. 18. Baily GG, Kranhn JB, Drasar BS, Stoker NG. Detection of melitensis and abortus by DNA amplification. J Trop Med Hyg, 1992; 95: 271–7.
19. 19. Ariza J, Pellicer T, Pallares R, Foz A, Gudiol F. Specific antibody profile in human brucellosis. Clin Infect Dis, 1992; 14(1): 131-40.
20. 20. Yüce A, Alp-Çavuş S. Türkiye’de bruselloz: Genel bakış. Klimik Derg, 2006; 19(3): 87-9.
21. 21. Apan TZ, Kaygusuz S, Kılıç D, Yıldırım A, Aksoy A, Ayaşlıoğlu E. Kırıkkale Üniversitesi Tıp Fakültesi Polikliniklerine Başvuran Kişilerde Bruselloz Seroprevalansı. İnfeksiyon Derg, 2004; 18(2): 175-8.
22. 22. Yu WL, Nielsen K. Review of detection of Brucella spp. by polymerase chain reaction. Croat Med J. 2010; 51(4): 306-13.
23. 23. Fekete A, Bantle JA, Halling SM, Sanborn MR. Preliminary development of a diagnostic test for using polymerase chain reaction. J Appl Bacteriol, 1990; 69: 216–27.
24. 24. Herman L, De Ridder H. Identification of Brucella spp. By using the polymerase chain reaction. Appl Environ Microbiol, 1992; 6: 2099-101.
25. 25. Romero C, Gamazo C, Pardo M, Lopez-Goni I. Specific detection of DNA by PCR. J Clin Microbiol, 1995; 33: 615–7.
26. 26. Navarro E, Escribano J, Fernandez J, Solera J. Comparison of three different PCR methods for detection of spp. in human blood samples. FEMS Immunol Med Microbiol, 2002; 34(2): 147-51.
27. 27. Nimri LF. Diagnosis of recent and relapsed cases of human brucellosis by PCR assay. BMC Infect Dis, 2003; 3: 5.
28. 28. Queipo-Ortuno MI, Morata P, Ocon P, Manchado P, Colmenero JD. Rapid diagnosis of human brucellosis by peripheral-blood PCR assay. J Clin Microbiol, 1997; 35: 2927-30.
29. 29. Matar GM, Khneisser IA, Abdelnoor AM. Rapid laboratory confirmation of human brucellosis by PCR analysis of a target sequence on the 31-kilodalton antigen DNA. J Clin Microbiol, 1996; 34: 477-8.
30. 30. Casanas MC, Queipo-Ortuno MI, Rodriguez-Torres A, Orduna A, Colmenero JD, Morata P. Specificity of a polymerase chain reaction assay of a target sequence on the 31-kilodalton Brucella antigen DNA used to diagnose human brucellosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2001; 20: 127-31.
31. 31. Mitka S, Anetakis C, Souliou E, Diza E, Kansouzidou A. Evaluation of different PCR assays for early detection of acute and relapsing brucellosis in humans in comparison with conventional methods J Clin Microbiol, 2007; 45(4): 1211-8.
32. 32. Al-Nakkas A, Mustafa AS, Wright SG. Largescale evaluation of a single-tube nested PCR for the laboratory diagnosis of human brucellosis in Kuwait. J Med Microbiol, 2005; 54(8): 727-30.
33. 33. Morata P, Queipo-Ortuno MI, Colmenero JD. Strategy for optimizing DNA amplification in a peripheral blood PCR assay used for diagnosis of human brucellosis. J Clin Microbiol, 1998; 36: 2243–6.
34. 34. Navarro E, Escribano, J, Solera, J. PCR assay for diagnosis of human brucellosis. J Clin Microbiol, 1999; 37(5): 1654-5.
35. 35. Çırak MY, Hızel K. Bruselozisin tanısında iki farklı gen bölgesini hedefleyen polimeraz zincir reaksiyonu yöntemlerinin değeri. Mikrobiyol Bul, 2002; 36: 271-6.
36. 36. Vrioni G, Gartzonika C, Kostoula A, Boboyianni C, Papadopoulou C, Levidiotou S. Application of a polymerase chain reaction enzyme immunoassay in peripheral whole blood and serum specimens for diagnosis of acute human brucellosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2004; 23(3): 194-9.
37. 37. Debeaumont C, Falconnet PA, Maurin M Real-time PCR for detection of Brucella spp. DNA in human serum samples. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2005; 24(12): 842-5.
38. 38. Queipo-Ortuno MI, Colmenero JD, Reguera JM, Garcia-Ordonez MA, Pachon ME, Gonzalez M, Morata P. Rapid diagnosis of human brucellosis by SYBR Green I-based real-time PCR assay and meltingcurve analysis in serum samples. Clin Microbiol Infect, 2005; 11(9): 713–8.
39. 39. Queipo-Ortuno MI, Colmenero JD, Baeza G, Morata P. Comparison between LightCycler real-time polymerase chain reaction (PCR) assay with serum and PCR-enzyme-linked immunosorbent assay with wholeblood samples for the diagnosis of human brucellosis. Clin Infect Dis, 2005; 40: 260-4.
40. 40. Morata P, Queipo-Ortuño MI, Reguera JM, García-Ordoñez MA, Pichardo C, Colmenero JD. Posttreatment Follow-Up of Brucellosis by PCR Assay. J Clin Microbiol, 1999; 37(12): 4163–6.