Moleküler mikrobiyoloji laboratuvarında ortam kontrolü nasıl yapılır?

Öz

Amaç: Moleküler mikrobiyoloji laboratuvarlarında invitro amplifikasyon reaksiyonu IVAR, İn vitro Amplifikasyon Reaksiyonları ürünleri ile çapraz kontaminasyon, çalışılan testlerde yanlış pozitifliğe neden olabilir. Bu durum, moleküler mikrobiyoloji laboratuvarlarında çok ciddi bir problemdir. Günümüzde moleküler mikrobiyoloji laboratuvarlarında iyi klinik laboratuvar uygulamaları GCLP, Good Clinical Laboratory Practice ile ilgili pek çok kaynak mevcut olmasına rağmen ortam kontrolünün nasıl yapılacağı hususunda halen özgün araştırmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmanın amacı, moleküler mikrobiyoloji laboratuvarında ortam kontrolünün nasıl yapılabileceği konusunda edindiğimiz tecrübelerin paylaşmaktır. Yöntem: Halk Sağlığı Genel Müdürlüğü, Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarları Daire Başkanlığına bağlı, “Ulusal Moleküler Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarı UMMRL ”nda, TS EN ISO 15189 standardına dayalı kalite yönetim sistemi KYS kapsamındaki, kalite ve akreditasyon çalışmalarında ilk kez moleküler mikrobiyoloji laboratuvarında ortam kontrolünün nasıl yapılacağı hususu ele alınmış ve laboratuvar koşullarında optimize edilmiştir. Söz konusu çalışmalar; laboratuvar güvenliğineuygun olacak şekilde yürütülmüş ve sonuç olarak bir talimat ÇT03/MRLDB-06 kodlu ve 15.11.2014/01 tarihli haline getirilmiştir. Bu talimatta, laboratuvarımızdaki çalışma ortamının kontrolü için, dokuz alan belirlenmiş, bu alanlardan ne şekilde örnek alınacağı, bu örneklerin nasıl test edileceği, sonuçların nasıl değerlendirileceği ve kayıt edileceği detaylı bir şekilde tarif edilmiştir. Seçilen alanlardan alınan örnekler, laboratuvarımızda optimize edilen sekans bazlı 16S rRNA testi ile analiz edilmiştir. Bulgular: ÇT03/MRLDB-06 talimatı uyarınca, UMMRL’deki TS EN ISO 15189 standardına dayalı KYS kapsamındaki ortam kontrolü çalışmalarında, UMMRL’deki ortam kontrolü incelemelerinde, seçili alanlardan alınan örneklerin hiçbirinde nükleik asit kontaminasyonuna rastlanmamıştır. Elde edilen sonuçlar, ilgili kalite formları kullanılarak kayıt altına alınmıştır. Sonuç: Moleküler mikrobiyoloji laboratuvarlarında çapraz bulaş ya da nükleik asit kontaminasyonunun önlenmesi için periyodik olarak ortam kontrolünün yapılması gereklidir. Günümüzde IVAR ürünlerinin kontrolü giderek önem kazanmakta ve laboratuvar akreditasyon kuruluşları sertifikasyon için klinik laboratuvarlarda, ortam kontrolünün sağlanmasını istemektedirler. Bu çalışmanın, moleküler mikrobiyoloji laboratuvarlarında ortam kontrolü ve laboratuvar güvenliği konularını ele alınırken ve bu konularda kendi ihtiyaçlarına yönelik talimatlar oluşturulurken yararlı olabileceği kanaatindeyiz.

Anahtar Kelimeler

• çapraz kontaminasyon, ortam kontrolü, yanlış pozitiflik

How to control of the workspace environment in the molecular microbiology laboratory?

Öz

Objective: Cross-contamination with the product of “in vitro amplification reactions IVAR ” can cause false positive results in laboratory tests. This study is a more seriously problem for molecular microbiology laboratories. In the recent, although many sources can be obtained about good clinical laboratory practices GCLP for molecular microbiology laboratories, specific research is needed how to control of the workspace environment. The aim of this study, it is shared our laboratory experiences about control of the workspace environment for molecular microbiology laboratories. Methods: In the scope of the quality management system QMS based on TS EN ISO 15189 standard in “Public Health General Directorate, Department of Microbiology Reference Laboratories, National Molecular Microbiology Referans Laboratory NMMRL ”, it was dealed how to control of the work space environment in the molecular microbiology laboratory for the first time, and it was optimized in the laboratory conditions. These experiments were conducted in accordance with laboratory safety and as a result an instruction coded ÇT03 / MRLDB-06, dated 15.11.2014/01 was formed. In this instruction, nine areas have been identified in our laboratory for the control of the laboratory workspace environment, how these samples will be taken from these areas, how these samples will be tested, how the results will be assessed and how they will be recorded have been described in detail. The samples from the selected areas were analyzed with the sequence-based 16S rRNA assay optimized in our laboratory. Results: According to the instructions of ÇT03 / MRLDB-06 within the scope of QMS based on TS EN ISO 15189 standard, nucleic acid contamination were not found in none of the samples taken from selected areas in NMMRL workspace environment control studies. The results obtained are recorded using the relevant quality forms. Conclusion: Periodic control of the workspace environment in the molecular microbiology laboratory is required to prevent cross contamination or nucleic acid contamination. Today, control of IVAR products is getting more and more important, and laboratory accreditation organizations demand the control of the workspace environment in clinical laboratories for certification. We believe that this study can be useful when discussing workspace environment control and laboratory safety issues in molecular microbiology laboratories and preparing instructions for their own needs in this regard.

Anahtar Kelimeler

• cross contamination, control of the workspace environment, false positives

Kaynakça

1. 1. Mifflin TE. Control of contamination associated with PCR and other amplification reactions. Clin Chem News, 1992; 18: 8-15.
2. 2. Lo YM, Mehal WZ, Fleming KA. False-positive results and the polymerase chain reaction. Lancet, 1988; 2(8612): 679.
3. 3. Kitchin PA, Szotyori Z, Fromholc C, Almond N. Avoidance of PCR false positives. Nature, 1990; 344(6263): 201.
4. 4. Hughes T, Janssen JW, Morgan G, Martiat P, Saglio G, Pignon JM, et al. False-positive results with PCR to detect leukaemia-specific transcript. Lancet, 1990; 335(8696): 1037-8.
5. 5. Anonymous. İyi Laboratuvar Uygulamaları Prensipleri ve Test Laboratuvarlarının Belgelendirilmesine Dair Yönetmelik. h t t p s : / / w w w. s a g l i k . g o v. t r / T R , 1 0 4 5 0 / i y i - laboratuvaruygulamalari-prensipleri-ve-test-laboratuvarlarininbelgelendirilmesine-dair-yonetmelik.html, (Erişim Tarihi: 25.02.2018).
6. 6. Anonmyous. Good Clinical Laboratory Practice (GCLP). http://www.who.int/tdr/publications/ documents/ gclp-web.pdf, (Erişim Tarihi: 25.02.2018).
7. 7. Viana RV, Wallis CL. Good clinical laboratory practice (GCLP) for molecular based tests used in diagnostic laboratories. In: Akyar I, ed. Wide Spectra of Quality Control. 1st ed. Rijeka, Croatia: Intech, 2011: 30–34.
8. 8. Edwards U, Rogall T, Blöcker H, Emde M, Böttger EC. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res, 1989; 17(19): 7843-53.

9. 9. Amann RI, Krumholz L, Stahl DA. Fluorescentoligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology. J Bacteriol, 1990; 172(2): 762-70.
10. 10. Lane DJ, Pace B, Olsen GJ, Stahl DA, Sogin ML, Pace NR. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proc Natl Acad Sci USA, 1985; 82(20): 6955-9.
11. 11. Relman DA, Schmidt TM, MacDermott RP, Falkow S. Identification of the uncultured bacillus of Whipple’s disease. N Engl J Med, 1992; 327(5): 293-301.
12. 12. Wilson KH, Blitchington RB, Greene RC. Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1990; 28(9): 1942-6.
13. 13. Eden PA, Schmidt TM, Blakemore RP, Pace NR. Phylogenetic analysis of Aquaspirillum magnetotacticum using polymerase chain reactionamplified 16S rRNA-specific DNA. Int J Syst Bacteriol, 1991; 41(2): 324-5.
14. 14. Maiwald M. Broad-range PCR for detection and identification of bacteria. In: Persing DH, Tenover FC, Tang YW, Nolte FS, Hayden RT, van Belkum A, eds. Molecular Microbiology: Diagnostic Principles And Practice. 2nd edition. Washington DC: American Society for Microbiology. 2011: 491-505.
15. 15. Kwok S, Higuchi R. Avoiding false positives with PCR. Nature, 1989; 339(6221): 237-8.
16. 16. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Press, 1989.
17. 17. Kwok S. Procedures to minimize PCR product carryover. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. San Diego: Academic Press, 1990: 142-5.
18. 18. Fischer M, Renevey N, Thür B, Hoffmann D, Beer M, Hoffmann B. Efficacy assessment of nucleic acid decontamination reagents used in molecular diagnostic laboratories. PLoS One, 2016; 11(7): e0159274.
19. 19. van Klingeren B, Koller W, Bloomfield SF, Böhm R, Cremieux A, Holah J, et al. Assessment of the efficacy of disinfectants on surfaces. Int Biodeter Biodegr, 1998; 41(3–4): 289–96.
20. 20. Reybrouck G. The testing of disinfectants. Int Biodeter Biodegr, 1998; 41(3–4): 269–72.
21. 21. Vandewoestyne M, Van Hoofstat D, De Groote S, Van Thuyne N, Haerinck S, Van Nieuwerburgh F, et al. Sources of DNA contamination and decontamination procedures in the forensic laboratory. J Forensic Res, 2011; (2): S2-001.
22. 22. Prince AM, Andrus L. PCR: how to kill unwanted DNA. Biotechniques, 1992; 12(3): 358–60.
23. 23. Ou CY, Moore JL, Schochetman G. Use of UV irradiation to reduce false positivity in polymerase chain reaction. Biotechniques, 1991; 10(4): 442-5.
24. 24. Niederhauser C, Höfelein C, Wegmüller B, Lüthy J, Candrian U. Reliability of PCR decontamination systems. PCR Methods Appl, 1994; 4(2): 117-23.
25. 25. Pao CC, Hor JJ, Tsai PL, Horng MY. Inhibition of in vitro enzymatic DNA amplification reaction by ultraviolet light irradiation. Mol Cell Probes, 1993; 7(3): 217-9.
26. 26. Salter SJ, Cox MJ, Turek EM, Calus ST, Cookson WO, Moffatt MF, et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol, 2014; 12: 87.