Endüstriyel enzimler üreten Bacillus izolatlarının morfolojik, biyokimyasal ve moleküler yöntemlerle karakterizasyonu

Öz

Amaç: Bacillus cinsine ait türlerin tanımlanmasında türler arasındaki moleküler benzerliklerin fazla olması nedeniyle ayrım zorlaşmaktadır. Bu çalışma kapsamında, özellikle birbiriyle yakın akraba olan gruplar arasında karşılaştırma yaparak türlerin karakterize edilmesi amaçlanmıştır. Moleküler tanımlaması yapılan ve fenotipik özellikleri belirlenen izolatların endüstriyel kullanımları da ayrıca irdelenmiştir. Yöntem: Kocaeli ilinin farklı bölgelerinden Kocaeli Üniversitesi Kampüsü Kent Ormanı, Yuvacık Baraj Yolu üzerindeki tarlalar ve dere kenarı alınan toprak örnekleri pastörizasyon işleminden sonra seri seyreltmeler hazırlanarak nutrient agar plaklara yayma ekim yapılmıştır. Bacillus benzeri koloniler morfolojik karakterlerine göre tek tek seçilip tekrar yayma ekimle saflaştırılmış ve numaralandırılmıştır. Bacillus cinsine ait olanlarda önce korunmuş bir gen bölgesi olan ve sınıflandırmada yaygın olarak kullanılan 16S ribozomal RNA 16S rRNA gen dizi analizi gerçekleştirilmiştir. Yakın akraba olanları birbirinden ayırmak için ilave moleküler gyrB gen bölgesinin Sau3AI enzimi ile muamele edilmesi ve biyokimyasal seçici besiyerlerinde gelişme analizler yapılmıştır. Filogenetik analizler NJ neighbour joining metodu ile gerçekleştirilmiştir. İzolatlar ayrıca fizyolojik özellikleri açısından karşılaştırılmıştır. Bulgular: İzolatlara ait yedi farklı Bacillus türü Y1: B. cereus, Y7: B. pumilus, Y12: B. megaterium, Y13: B. methylotrophicus, Y15: B. subtilis, Y35: B. licheniformis ve Y38: B. sonorensis tanımlanmış ve her bir izolatın fizyolojik özellikleri kaydedilmiştir. Buna göre tüm izolatlar 30 ila 45°C sıcaklık aralığında ve pH’sı 9 olan besi ortamında gelişme göstermiştir. Diğer yandan Y7, Y15, Y35 ve Y38 numaralı izolatlar 50°C’ye kadar olan sıcaklıklarda büyüme yeteneklerini korumuşlardır. Aralarında tuza en fazla tolerans gösterenin B. licheniformis olarak tanımlanmış olan Y35 numaralı izolat olduğu gözlenmiştir. Bu izolat yaklaşık %12 w/v oranında tuz içeren ortamda gelişebilmektedir. Tuza karşı duyarlılığı en fazla olan izolatlar ise B. cereus ve B. megaterium olarak tanımlanan Y1 ve Y12 numaralı izolatlar olup büyümelerinin %5’lik w/v NaCl’da durduğu kaydedilmiştir. Sonuç: Yapılan bu çalışmada izolatların tür tanımlanması için seçilen 16S rRNA ve gyrB gen bölgelerinin, Bacillus’ların moleküler düzeyde ayırımında kullanılabileceği gösterilmiştir. Gerçekleştirilen biyokimyasal testler, moleküler analiz bulgularını desteklemiştir. İzolatların sıcaklık, pH ve tuz toleransları endüstride hali hazırda kullanılan Bacillus’larla karşılaştırılmış ve birçoğunun benzer fizyolojik koşullarda gelişme gösterdiği gözlenmiştir. Diğer yandan, izolatlardan Y1’in literatürde rapor edilen B. cereus suşlarından daha geniş bir pH aralığında gelişme gösterdiği bulunmuştur. B. licheniformis olarak tanımlanmış Y35 izolatında gözlenen yüksek tuz konsantrasyonu %12, w/v içeren ortamlarda gelişebilme yeteneği ise toprak Bacillus’larında ilk defa bu çalışmada sunulmuştur. Sonuç olarak, Y1 ve Y35 başta olmak üzere tür tanımlaması yapılan tüm izolatların endüstriyel biyoteknoloji alanında özgün enzim ya da toksin üretimi, ilaç hammadde sentezi gibi veya benzeri çalışmaların yapılmasına olanak sağlayabilecekleri düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler

• Bacillus, tanımlama, endüstri, filogeni, fizyoloji

Morphological, biochemical and molecular characterization of Bacillus isolates as a producer of industrial enzymes

Öz

Objective: The identification of Bacillus strains which are genetically related have become difficult. The aim of this study was to characterize the closely related groups of species by making comparisons. The industrial use of isolates that have been identified by molecular methods and their phenotypic properties documented have also been examined. Methods: Soil samples were collected from different locations in Kocaeli town Kocaeli University Campus, fields and creeks on Yuvacık Dam Road, Kent Forest , spread onto nutrient agar plates after pasteurization process followed by serial dilutions. Bacilli-like colonies were isolated according to their morphological characters. Individual colonies from each site were picked up, purified by re-streaking and numbered. Among a number of isolates, the ones belonging to Bacillus genus were subjected to 16S ribosomal RNA 16S rRNA gene sequencing which is widely practiced technique due to the slow rates of evolution of this region of the gene. To discriminate the members of closely relaxed taxa, additional molecular restriction digestion of gyrB gene with Sau3AI enzyme and biochemical analyses growth in selective media were performed. Phylogenetic trees were constructed using the neighbor-joining method. The isolated were also analyzed in terms of their tolerance against different physiological conditions and the biochemical characteristics of them were compared with reference strains. Results: 7 different isolates Y1; B. cereus, Y7; B. pumilus, Y12; B. megaterium; Y13; B. methylotrophicus, Y15; B. subtilis, Y35; B. licheniformis, Y38; B. sonorensis have been identified to species level and physiological characteristics of each have been documented. Accordingly, all isolates were able to grow at temperatures from 30 to 45°C and pH 9. The isolates numbered as Y7, Y15, Y35 and Y38 were observed to tolerate temperatures up to 50°C. Among all, B. licheniformis numbered as Y35 presented the highest tolerance to salt concentration of 12% w/v . The most sensitive ones to salt were B. cereus and B. megaterium numbered as Y1 and Y12, respectively. Those isolates did not grow in the presence of 5% w/v NaCl concentration. Conclusion: The 16S rRNA and gyrB genes, selected to identify the isolates, have been proven to be used for classification of Bacilli at molecular level. Biochemical tests confirmed the molecular analysis outcomes. Temperature, pH and salt tolerance of the isolates were compared with the Bacillus species already used in industry. Many of them presented similar growth potential against to the physiological conditions tested. On the other hand, the isolate Y1 was found to show ability to grow broad pH range than those reported for B. cereus. The capability of a soil B. licheniformis, isolate Y35, to grow in medium with high salt 12%, w/v was presented for the first time. In summary, the isolated and identified Bacillus species here are believed to promote many studies including novel enzyme, toxin and pharmaceutically important compound production in industrial biotechnology field.

Anahtar Kelimeler

• Bacillus, identification, industry, phylogeny, physiology

Kaynakça

1. 1. Öztürk F. Ankara’daki topraklardan izole edilen Bacillus türlerinin tanımlanması, moleküler düzeyde tiplendirilmesi ve biyolojik aktivitelerinin belirlenmesi. Doktora Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 2007.
2. 2. Brenner DJ, Krieg NR, Garrity GM, Staley JT. Genus Bacillus Cohn 1872. In Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Springer US, 2005: 1105- 40.
3. 3. Kalaylı E, Beyatlı Y. Bacillus cinsi bakterilerin antimikrobiyal aktiviteleri, PHB üretimleri ve plazmid DNA’ları. Orlab On-Line Mikrobiyol Derg, 2003; 1 (12): 24-35.
4. 4. Hanlon GW, Hodges NA. Bacitracin and protease production in relation to sporulation during exponential growth of Bacillus licheniformis on poorly utilized carbon and nitrogen sources. J Bacteriol, 1981; 147 (2): 427-31.
5. 5. Parthipan P, Preetham E, Machuca LL, Rahman PK, Murugan K, Rajasekar A. Biosurfactant and degradative enzymes mediated crude oil degradation by bacterium Bacillus subtilis A1. Front Microbiol, 2017; 8: 193.
6. 6. Palomba R, Formisano G, Arrichiello A, Auriemma G, Sarubbi F. Development of a laboratory technique for the evaluation of protease enzymes activity in goat and sheep milk. Food Chem, 2017; 221: 1637-41.
7. 7. Saranya P, Sukanya Kumari H, Prasad Rao B, Sekaran G. Lipase production from a novel thermotolerant and extreme acidophile Bacillus pumilus using palm oil as the substrate and treatment of palm oil-containing wastewater. Environ Sci Pollut Res, 2014; 21: 3907-19.
8. 8. Aghari S, Wadhwa N. Isolation and characterization of feather degrading enzymes from Bacillus megaterium SN1 isolated from Ghazipur poultry waste site. Appl Microbiol Biotechnol, 2012; 48 (2): 175-81.

9. 9. Rosovitz MJ, Voskuil MI, Chambliss GH. Bacillus, systematic bacteriology. In: Collier L, Balows A, Susman M, eds. Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Oxford University Press, 1998: 5-730.
10. 10. Chang YH, Shangkuan YH, Lin HC, Liu HW. PCR assay of the GroEL gene for detection and differentiation of Bacillus cereus group cells. Appl Environ Microbiol, 2003; 69 (8): 4502-10.
11. 11. Kim HS, Lee DW, Woo SD, Yu MY, Kang KS. Distribution, serological identification, and PCR analysis Bacillus thuringiensis isolated from soils of Korea. Curr Microbiol, 1998; 37 (3): 195-200.
12. 12. Singh S, Moholkar VS, Goyal A. Isolation, identification and characterization of a cellulolytic Bacillus amyloliquefaciens strain SS35 from rhinoceros dung. ISRN Microbiol, 2013; 728134: 7.
13. 13. Manzano M, Cocolin L, Cantoni C, Comi G. Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis and Bacillus mycoides differentiation using a PCR-RE technique. Int J Food Microbiol, 2003; 81 (3): 249-54.
14. 14. Collins CH, Lyne PM, Grange JM, Falkinham JO. Collins and Lyne’s Microbiological Methods, 8th ed. London: Arnold, 2004.
15. 15. Palmisano M, Nakamura L, Duncan K, Istock C, Cohan, F. Bacillus sonorensis sp. nov., a close relative of Bacillus licheniformis, isolated from soil in the Sonoran Desert, Arizona. Int J Syst Evol Microbiol, 2001; 51 (5): 1671-79.
16. 16. Kalkan S, Halkman K. Bacillus cereus’un standart analiz yöntemi. Orlab On-Line Mikrobiyol Derg, 2006; 4 (3): 31-6.
17. 17. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol Biol Evol, 2013; 30 (12): 2725-29.
18. 18. Akşit F, Akgün Y, Kiraz N. Genel Mikrobiyoloji ve İmmünoloji. 8. baskı, Anadolu Üniversitesi Yayınları, Eskişehir, 2006.
19. 19. Gordon RE, Haynes WC, Pang CHN. The Genus Bacillus. In: Agriculture Handbook No.427, D.C. United States Department of Agriculture, Washington, DC. 1973: 98-9.
20. 20. Çetinkaya E, Ayhan K. Mikrobiyolojide kullanılan bazı moleküler teknikler. Karaelmas Fen Müh Derg, 2012; 2 (1): 53-62.
21. 21. Wang L-T, Lee F-L, Tai C-J, Kasai H. Comparison of gyrB gene sequences, 16S rRNA gene sequences and DNA–DNA hybridization in the Bacillus subtilis group. Int J Syst Evol Microbiol, 2007; 57: 1846-50.
22. 22. Duman Y, Yüzügüllü YK, Sertel A, Polat F. Production, purification and characterization of a thermo-alkali stable and metal-tolerant carboxymethylcellulase from newly isolated Bacillus methylotrophicus Y37. Turk J Chem, 2016; 40 (5): 802-15.
23. 23. Kubota H, Matsunobu T, Uotani K, Takebe H, Satoh A, Tanaka T, Taniguchi M. Production of poly (γ-glutamic acid) by Bacillus subtilis F-2-01. Biosci Biotechnol Biochem, 1993; 57 (7): 1212-13.
24. 24. Zheng YG, Chen J, Liu ZQ, Wu MH, Xing LY, Shen YC. Isolation, identification and characterization of Bacillus subtilis ZJB-063, a versatile nitrile-converting bacterium, Appl Microbiol Biotechnol, 2008; 77 (5): 985-93.
25. 25. Huang XW, Niu QH, Zhou W, Zhang KQ. Bacillus nematocida sp. nov., a novel bacterial strain with nematotoxic activity isolated from soil in Yunnan, China. Syst Appl Microbiol, 2005; 28 (4): 323-7.
26. 26. Mohandass R, Rout P, Jiwal S, Sasikala C. Biodegradation of benzo[α]pyrene by the mixed culture of Bacillus cereus and Bacillus vireti isolated from the petrochemical industry. J Environ Biol, 2012; 33 (6): 985-9.
27. 27. Martinez S, Borrajo R, Franco I, Carballo J. Effect of environmental parameters on growth kinetics of Bacillus cereus (ATCC 7004) after mild heat treatment. Int J Food Microbiol, 2007; 117 (2): 223-7.
28. 28. Parvathi A, Krishna K, Jose J, Joseph N, Nair S. Biochemical and molecular characterization of Bacillus pumilus isolated from coastal envıronment in Cochin, India. Braz J Microbiol, 2009: 40 (2): 269-75.
29. 29. Salgaonkar BB, Mani K, Braganca JM. Characterization of polyhydroxyalkanoates accumulated by a moderately halophilic salt pan isolate Bacillus megaterium strain H16. J Appl Microbiol, 2013; 114: 1347-56.
30. 30. Singh G, Kumari A, Mittal A, Yadav A, Aggarwal NK. Poly –hydroxybutyrate production by Bacillus subtilis NG220 using sugar industry waste water. Biomed Res Int, 2013; 2013: 952641.
31. 31. Tang B, Xu H, Xu Z, Xu C, Xu Z, Lei P, Qiu Y, Liang J, Feng X. Conversion of agroindustrial residues for high poly(γglutamic acid) production by Bacillus subtilis NX-2 via solid-state fermentation, Bioresour Technol, 2015: 351-4.
32. 32. Kazeem MO, Md Shah UK, Baharuddin AS, AbdulRahman NA. Prospecting agro-waste cocktail: supplementation for cellulase production by a newly isolated thermophilic B. licheniformis 2D55. Appl Biochem Biotechnol, 2017; 182 (4): 1318-40.
33. 33. Laba W, Rodziewicz A. Biodegradation of hard keratins by two bacillus strains. Jundishapur J Microbiol, 2014; 7 (2): e8896
34. 34. Oren A. Industrial and environmental applications of halophilic microorganisms. Environ Sci Technol, 2010, 31: 825-834.
35. 35. Madigan MT, Brock T.D. Brock Biology of Microorganisms. 13th ed. London: Pearson, 2012.