Identification of Lactic Acid Bacterial Profile Effective on the Quality of Silages Prepared from Buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) by DNA Fingerprinting Techniques

Öz

In this study, it was aimed to obtain data about dominant strains and to determine lactic acid bacteria (LAB) profile in the silage samples prepared from buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench), grown in fields of the Faculty of Agriculture of Aydın Adnan Menderes University in Turkey's Aegean region, by using PCR-DNA-fingerprinting technique through M13 and (GTG)5 repeating sequence primers. In the study, 15 different silage samples prepared by adding 2 different concentrations (1.5x105-1.5x106 cfu g-1) of inoculant and 2 different concentrations (4-6 L t-1) of formic acid to buckwheat samples with different dry matter (DM) contents were used. First, DM, pH and Fleig points of 15 different silage samples, then total LAB numbers and the variety of LABs at genus level of these samples were determined. 50 isolates which were detected to be LAB from silage samples were obtained and Polymerase Chain Reaction (PCR) fingerprint profiles of these isolates were obtained using primers (GTG) 5 and M13 to detect LAB variety at species level. For the 50 LAB, a total of 52 loci with the M13 primer and 39 loci with the (GTG)5 primer were produced. The markers [M13 and (GTG)5] produced many different fragment profiles. According to the results of cluster and separation analysis, it was determined that both primers [M13 and (GTG)5] should be used for molecular characterization of LAB, isolated from silage samples. When samples with different DM ratio (20%, 30%, 40%) were examined in terms of microbial diversity and quality, 30% DM content came into prominence. The rise of the number of Enterococcus in samples with 30% and 40% DM content and the increase in silage quality in parallel shows that Enterococcus number can be effective on silage quality. Two of the isolates obtained in this study have the potential to become a silage starter. In the light of these data, it can be said that buckwheat silage containing 30% DM will be a quality silage with high LAB diversity and an alternative roughage.

Anahtar Kelimeler

• Silage
• buckwheat
• DNA-fingerprinting
• Enterococcus
• formic acid

Karabuğday (Fagopyrum esculentum Moench) Bitkisinden Hazırlanan Silaj Örneklerinin Kalitesi Üzerine Etkili Olan Laktik Asit Bakteri Profilinin DNA Parmak İzi Tekniği ile Tanımlanması

Öz

Bu çalışmada, Türkiye’nin Ege Bölgesi’nde yer alan Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Ziraat Fakültesi deneme alanında yetiştirilen karabuğday (Fagopyrum esculentum Moench)’dan hazırlanan silaj örneklerindeki laktik asit bakteri (LAB) profillerinin M13 ve (GTG)5 tekrarlı dizi primerleri ile PCR-DNA-parmak izi tekniği kullanılarak belirlenmesi ve baskın suşlar hakkında veri elde edilmesi hedeflenmiştir. Çalışmada, farklı kuru madde (KM) içeriklerine sahip karabuğday örneklerine 2 farklı konsantrasyonda (1.5x105-1.5x106 kob g-1) inokulant ve 2 farklı konsantrasyonda (4-6 L t-1) formik asit ilave edilerek hazırlanan 15 farklı silaj örneği kullanılmıştır. İlk olarak 15 farklı silaj örneğinin KM, pH ve Fleig puanları, daha sonra bu örneklerin toplam LAB sayıları ve LAB’ların cins düzeyinde çeşitliliği belirlenmiştir. Silaj örneklerinden laktik asit bakterileri olduğu tespit edilen 50 izolat elde edilmiş ve LAB çeşitliliğini tür düzeyinde tespit etmek amacıyla (GTG)5 ve M13 primerleri kullanılarak bu izolatların Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) parmak izi profilleri elde edilmiştir. Çalışmada kullanılan 50 LAB izolatı için M13 primeri ile toplamda 52 lokus, (GTG)5 primeri ile 39 lokus üretilmiştir. Markör [M13 ve (GTG)5] sistemi, farklı LAB türlerine ait izolatlar arasında önemli bir değişkenlik sağlayan çok sayıda fragment üretmiştir. Kluster ve ayrım gücü analizi sonuçlarına göre silaj örneklerinin LAB profilinin moleküler karakterizasyonu için her iki primerin de [M13 ve (GTG)5] kullanılması gerektiği belirlenmiştir. Farklı KM oranına (% 20, % 30, % 40) sahip örnekler mikrobiyal çeşitlilik ve kalite açısından incelendiğinde, % 30 KM içeriği ön plana çıkmaktadır. Çalışmada, % 30 ve % 40 KM içerikli örneklerde Enterococcus sayısının artması ve buna paralel olarak silaj kalitesinin de artması silaj kalitesi üzerine Enterococcus sayısının etkili olabileceğini göstermektedir. Bu çalışmada elde edilen izolatlardan iki tanesinin silaj starteri olabilme potansiyeli bulunmaktadır. Bu veriler ışığında % 30 KM içeren karabuğday silajının yüksek LAB çeşitliliğine sahip kaliteli bir silaj ve alternatif kaba yem olacağı söylenebilir.

Anahtar Kelimeler

• Silaj
• karabuğday
• DNA-parmak izi
• Enterococcus
• formik asit

Kaynakça

1. Akyıldız, R., 1984. Yemler Bilgisi Laboratuvar Kılavuzu. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları, No: 358, Ankara.
2. Alçiçek, A., Tarhan, F., Özkan, K., Adışen, F., 1999. İzmir ili civarında bazı süt sığırcılığı işletmelerinde yapılan silo yemlerinin besin madde içeriği ve silaj kalitelerinin saptanması üzerine bir araştırma. Hayvansal Üretim Dergisi, 39-40: 54-63.
3. Altınok, S., Genç, A., Erdoğdu, İ., 2005. Farklı ekim şekillerinde yetiştirilen mısır ve soyadan elde edilen silajlarda kalite özelliklerinin belirlenmesi. Türkiye VI. Tarla Bitkileri Kongresi, 5-9 Eylül, Antalya, Cilt II, s. 1011-1016.
4. Amelchanka, S.L., Kreuzer, M., Leiber, F., 2010. Utility of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) as feed: Effects of forage and grain on in vitro ruminal fermentation and performance of dairy cows. Animal Feed Science and Technology, 155(2-4): 111-121.
5. Arslan, M., Çakmakçı, S., 2011. Mısır (Zea mays) ve sorgumun (Sorghum bicolor) farklı bitkilerle birlikte yapılan silajlarının karşılaştırılmaları. Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 24(1): 47-53.
6. Bingöl, N.T., Karslı, M.A., Bolat, D., Akça, İ., 2008. Vejetasyonun farklı dönemlerinde hasat edilen korungaya ilave edilen melas ve formik asit’ in silaj kalitesi ve in vitro kuru madde sindirilebilirliği üzerine etkileri. Yeni Yüzyıl Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 2: 61-66.
7. Bulut, Ç., 2003. Isolation and characterization of lactic acid bacteria from cheese. Yüksek Lisans Tezi, İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü, İzmir.
8. Dumlu, G.Z., Fayetörbay, D., Tan, M., 2013. Effects of some additives, harvest stage and wilting on alfalfa silage. Atatürk Universty Journal of the Agricultural Faculty, 46(2): 113-118.

9. Eliş, S., Özyazıcı, M.A., 2019. Determination of the silage quality characteristics of different switchgrass (Panicum virgatum L.) cultivars. Applied Ecology and Environmental Research, 17(6): 15755-15773.
10. Fabiszewska, A.U., Zielińska, K.J., Wróbel, B., 2019. Trends in designing microbial silage quality by biotechnological methods using lactic acid bacteria inoculants: a minireview. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 35(5): 76.
11. Filya, İ., 2001. Silaj Teknolojisi. Alltech Bilimsel Yayınlar Serisi, Hakan Ofset, İzmir.
12. Filya, İ., 2002a. Laktik asit bakteri ve laktik asit bakteri+enzim karısımı silaj inokulantlarının mısır silajı üzerine etkileri. Turkish Journal of Vetenary and Animal Science, 26(3): 679- 687.
13. Filya, İ., 2002b. Laktik asit bakteri inokulantlarının mısır ve sorgum silajlarının fermantasyon, aerobik stabilite ve in situ rumen parçalanabilirlik özellikleri üzerine etkileri. Turkish Journal of Vetenary and Animal Science, 26(4): 815-823.
14. Filya, İ., Ashbell, G., Hen, Y., Weinberg, Z.G., 2000. The effect of bacterial inoculants on the fermentation and aerobic stability of whole crop wheat silage. Animal Feed Science and Technology, 88(1-2): 39-46.
15. Filya, İ., Sucu, E., 2004. Formik asit temeline dayalı bir koruyucunun mısır ve sorgum silajlarının aerobik stabiliteleri üzerine etkisi. 4. Ulusal Zootekni Bilim Kongresi, Bildiriler kitabı, 1-3 Eylül, Isparta, s. 424-428.
16. Filya, İ., Sucu, E., 2007. The effect of bacterial inoculants and a chemical preservative on the fermentation and aerobic stability of whole-crop cereal silages. Asian-Australian Journal Animal Science, 20(3): 378-384.
17. Harrigan, W.F., McCance, M.E., 1976. Basic methods. In: W.F. Harrigan (Ed.), Laboratory Methods in Food and Dairy Microbiology, Revised Edition, Academic Press, London, pp. 3-16.
18. Henderson, A.R., McDonald, P., 1984. The effect of a range of commercial inoculants on the biochemical changes during the ensilage of grass in laboratory studies. Research of Development in Agricultural, 3: 167-171.
19. Hounhouigan, D.J., Nout, M.J.R., Nago, C.M., Houben, J.H., Rombouts, F.M., 1993. Characterization and frequency distribution of species of lactic acid bacteria involved in the processing of maw, a fermented maize dough from Benin. International Journal of Food Microbiology, 18: 279-287.
20. Kara, B., Ayhan, V., Akman, Z., Adıyaman, E., 2009. Determination of silage quality, herbage and hay yield of different triticale cultivars. Asian Journal of Animal Vetenary Advence, 4(3): 167-171.
21. Keleş, G., Kocaman, V., Üstündağ, A.Ö., Zungur Bastıoğlu, A., Özdoğan, M., 2018. Growth rate, carcass characteristics and meat quality of growing lambs fed buckwheat or maize silage. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 31(4): 522-528.
22. Kılıç, A., 1986. Silo Yemi. Bilgehan Basımevi, İzmir.
23. Leiber, F., Kunz, C., Kreuzer, M., 2012. Influence of different morphological parts of buckwheat (Fagopyrum esculentum) and its major secondary metabolite rutin on rumen fermentation in vitro. Czech Journol of Animal Science, 57(1): 10-18.
24. Li, W., Raoult, D., Fournier, P.E., 2009. Bacterial strain typing in the genomic era. FEMS Microbiology Reviews, 33(5): 892-916.
25. Marciňáková, M., Lauková1, A., Simonová1, M., Strompfová1, V., Koréneková, B., Nad, P., 2008. A new probiotic and bacteriocin-producing strain of Enterococcus faecium EF9296 and its use in grass ensiling. Czech Journal of Animal Science, 53(8): 336-345.
26. McAllister, T.A., Dunière, L., Drouin, P., Xu, S., Wang, Y., Munns, K., Zaheer, R., 2017. Silage review: Using molecular approaches to define the microbial ecology of silage. Journal of Dairy Science, 101(5): 4060-4074.
27. Meeske, R., Basson, H.M., Cruywagen, C.W., 1999. The effects of a lactic acid bacteria inoculant with enzymes on the fermantation dynamics, intake and digestibility of digitaria eriantha silage. Animal Feed Science Technology, 81(3-4): 237-248.
28. Merry, R.J., Cussen, R.F., Mackenna, A.P., Wıllıams, J., Tweed, S., 1993. The effect of different inoculants on fermentation and proteolsis in silages of differing perrinial ryegrass and white clover content. Proceedings of the 10th International Silage Conference, September 6-8, Dublin, pp. 83-84.
29. Moran, J., Weinberg, Z.G., Ashbell, G., Hen, Y., Owen, T.R., 1996. The effects of bacterial inoculant on the fermantation and aerobic stability of whole crop wheat silage. Proceedings of the 11th International Silage Conference, September 8-11, Aberystwyth, pp. 164-165.
30. Muck, R.E., 2004. Effect of corn silage inoculants on aerobic stability. American Society of Agricultural Engineers, 47(4): 1011-1016.
31. Özkan, U., 2020. Türkiye yem bitkileri tarımına karşılaştırmalı genel bakış ve değerlendirme. Turkish Journal of Agricultural Engineering Research, 1(1): 29-43.
32. Özyazıcı, M.A., Turan, N., Açıkbaş, S., 2018. İkinci ürün olarak yetiştirilen bazı sorgum, sudanotu, sorgum x sudanotu melezi ve mısır çeşitlerinin silaj kalitelerinin belirlenmesi. UMTEB III. Uluslararası Mesleki ve Teknik Bilimler Kongresi, 21-22 Haziran, Tam Metin Kitabı, Cilt-6, Gaziantep, Türkiye, s. 3898-3907.
33. Rohlf, F.J., 2000. NTSYS-pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Version 2.1, Exeter Software Setauket, New York.
34. Santos, A., Ávila, C., Soares, C., Carvalho, B.F., Schwan, R.F., Lima, N., 2019. Lactic acid bacteria diversity in corn silage produced in Minas Gerais (Brazil). Annals of Microbiology, 69: 1445-1459.
35. Stokes, M., Chen, J., 1994. Effects of an enzyme-inoculant mixture on the course of fermentation of corn silage. Journal of Dairy Science, 77: 3401-3409.
36. Tan, M., Serin, Y., 2008. Silaj yapım tekniği. Y. Serin (Ed.), Yem Bitkileri ve Meraya Dayalı Hayvancılık Eğitimi, Erciyes Üniversitesi Yayınları, Kayseri, s. 271-286.
37. Vandamme, P., Bruyne, K., Pot, B., 2014. Phylogenetics and systematics. In: W.H. Holzapfel, B.J.B. Wood (Eds.), Lactic Acid Bacteria-Biodiversity and Taxonomy, Wiley, Chichester, pp. 31-45.
38. Weinberg, Z.G., Ashbell, G., Azrieli, A., Brukental, I., 1993. Ensiling peas, ryegrass and wheat with additives of lactic acid bacteria (LAB) and cell wall degrading enzymes. Grass and Forage Science, 48(1): 70-78.