Solanum lycopersicum Ekspanzin (LeExp1) Geni İçeren Rekombinant Pichia pastoris Protein Ekspresyon Vektörünün Dizaynı ve Oluşturulması

Abstract

Bu çalışmanın amacı rekombinant ekspanzin proteini üretim amacıyla kullanılacak olan LeExp1-pPIC9K vektörünün dizayn edilmesi ve oluşturulmasıdır. Bu amaçla domates (Solanum lycopersicum) genomundan toplam RNA izole edilmiş ve spesifik primerler vasıtasıyla RT-PZR yöntemiyle LeExp1 genine ait olan komplementer DNA (cDNA) sentezlenmiş ve çoğaltılmıştır. LeExp1 genine ait cDNA pPIC9K vektörüne aktarılmadan önce EcoRI ve NotI restriksiyon enzimleriyle kesilmiş ve yine bu enzimlerle kesilmiş olan pPIC9K vektörüne DNA ligaz enzimi kullanılarak eklenmiştir. Klonlama işlemi sonrasında hedef geni içeren vektör JM109 kompetent E. coli hücrelerine ısı şoku uygulamasıyla transforme edilmiş ve antibiyotikli besiyerinde seçilim gerçekleştirilmiştir. Antibiyotik pozitif olan tek kolonilerin hedef geni taşıyıp taşımadıkları koloni PZR yöntemiyle doğrulanmış ve E. coli hücrelerinden plazmid DNA’ler ekstrakte edilmiştir. PZR sonuçlarına göre 918 baz çiftlik LeExp1 geninin vektör içerisindeki varlığı tespit edilmiş ve dizi analizleriyle doğru nükleik asit sekansına sahip olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmanın sonucunda moleküler analizler kullanılarak rekombinant ekspanzin proteinin üretilebilmesi için gerekli olan vektörün doğru bir şekilde oluşturulduğu ortaya konulmuştur.

Keywords

• Ekspanzin; Pichia pastoris; rekombinant protein; pPIC9K

References

1. [1]. Demain, A.L., Vaishnav, P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms, Biotechnology Advances, 27, 297-306, 2009.
2. [2]. Falch, E.A. Industrial enzymes — Developments in production and application, Biotechnology Advances, 9, 643-658, 1991.
3. [3]. Hodgson, J. The changing bulk biocatalyst market. Biotechnology, 12, 289-290, 1994.
4. [4]. McQueen-Mason, S.J., Durachko, D.M., Cosgrove, D.J. Two endogenous proteins that induce cell wall extension in plants. Plant Cell 4, 1425–1433, 1992.
5. [5]. Cosgrove, D.J., Loosening of plant cell walls by expansins. Nature, 407, 321–326, 2000. [6]. Cosgrove, D.J. Cell wall loosening by expansins. Plant Physiology, 118, 333–339, 1998.
6. [7]. Rose, J.K.C., Lee, H.H., Bennett, A.B. Expression of a divergent expansin gene is fruit-specific and ripening regulated. Proc Natl Acad Sci USA, 94:5955–5960, 1997.
7. [8]. Brummell, D.A., Harpster MH, Civello PM, Palys JM, Bennett, AB, Dunsmuir P. Modification of expansin protein abundance in tomato fruit alters softening and cell wall polymer metabolism during ripening. Plant Cell, 11, 2203–2216, 1999.
8. [9]. Harrison, P.E., McQueen-Mason, S.J., Manning, K. Expression of six expansin genes in relation to extension activity in developing strawberry fruit. J Exp Bot 52, 1437–1446, 2001.

9. [10]. Gao, Z., Maurousset, L., Lemoine, R., Yoo, S-D., van Nocker, S., Loescher, W. Cloning, expression, and characterization of sorbitol transporters from developing sour cherry fruit and leaf sink tissues. Plant Physiol 131, 1566–1575, 2003.
10. [11]. Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M.A. A method for extracting intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. Hortiscience 27:440–442, 1992.