Oryctolagus cuniculus Kimozin Enzimini Pichia pastoris Mayasında İfade Edecek Vektörün Dizayn ve Jenerasyonu

Abstract

Bu çalışmada rekombinant tavşan pro-kimozin genini üretmek amacıyla kullanılacak olan pPIC9K-Chy vektörünün dizayn edilmesi ve çoğaltılması hedeflenmektedir. DNA bilgi bankalarında biyoinformatik analizler yapılarak tavşan pro-kimozin gen dizilimi belirlenmiştir. Elde edilen dizilimlere göre dizayn edilen primerler ile tavşandan genomundan kimozin enzimi izole edilmiştir. Hedef DNA sekansları PIC9K vektörüne EcoRI ve NotI restriksiyon enzimleriyle üzerinden klonlanmıştır. Klonlama işlemi sonrasında hedef geni içeren vektör, JM109 kompetent E. coli hücrelerine ısı şoku uygulamasıyla transforme edilmiş ve antibiyotikli besiyerinde seçilimleri gerçekleştirilmiştir. Antibiyotik pozitif olan tek kolonilerin hedef geni taşıyıp taşımadıkları koloni PZR yöntemiyle doğrulanmış ve E. coli hücrelerinden plazmid DNA’lar ekstrakte edilmiştir. Elde edilen plazmid DNA' lar elektroporasyon yöntemi ile Pichia pastoris kompetent maya hücrelerine aktarılmış ve aktarılan hücreler çeşitli konsantrasyonlarda antibiyotik içeren besi yerlerine ekilerek hedef geni taşıdıkları doğrulanmıştır.

Keywords

• Tavşan; Kimozin; Pichia pastoris; Rekombinant kimozin; pPIC9K

References

1. [1].Flamm, E.L., ''How FDA approved chymosin: A case history'', Nature Biotechnology, 9: 349–351, 1991.[2]. Foltmann, B., Pedersen V. B., Jacobsen M., Auffman, D., Wijbrandt G., ''The complete amino acid sequence of prochymosin'', Proc. Nat. Acad. Sci., 74: 2321–4, 1977.[3]. Houen, G., Madsen, M.T., Harlow, K.W., Lønblad, P., Foltmann, B., ''The primary structure and enzymic properties of porcine prochymosin and chymosin'' Int J Biochem Cell Biology. 28(6):667-675, 1996.[4]. Mohanty, A. K., Mukhopadhyay, U. K., Kaushık, J. K., Grover, S., and Batısh, V. K., ''Isolation, purification and characterization of chymosin from riverine buffalo (Bubalus bubalis)'', Journal of Dairy Research, 70(01): 37- 43, 2003.[5]. Rogelj, I., Perko, B., Francky, A., Penca, V., and Pungerčar, J.,'' Recombinant lamb chymosin as an alternative coagulating enzyme in cheese production'', Journal of dairy science, 84(5): 1020-1026, 2001.[6]. Vega-Hernández, M. C., Gómez-Coello, A., Vıllar, J., and Claverıe-Martı́n, F., ''Molecular cloning and expression in yeast of caprine prochymosin'', Journal of biotechnology, 114(1): 69-79, 2004.[7]. Kappeler, S. R., Van Den Brink, H. J., Rahbek- Nielsen, M., Farah, Z., Puhan, Z., Hansen, E., Johansen, E., ''Characterization of recombinant camel chymosin reveals superior properties for the coagulation of bovine and camel milk'', Biochem. Biophys. Res. Commun, 342: 647−654, 2006.[8]. Rao, S., Dutta, S.M., ''Extraction of rennet from abomasum of suckling buffalo calves'', Ind J Dairy Sci., 34 (2): 235–237, 1981.[9]. Manıatıs, T., Frıtsch, E. F., and Sambrook, J., ''Molecular cloning''. A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 545, 1982.