Pichia pastoris SMD1168 Suşu Kullanılarak Rekombinant Ekspanzin Üretimi

Abstract

Bu çalışmanın amacı son yıllarda rekombinant protein üretiminde başarılı bir şekilde kullanılan metilotropik P. pastoris SMD1168 suşunu kullanarak domates bitkisinden izole edilen ekspanzin enziminin üretilmesidir. Bu amaçla domates (Solanum lycopersicum) genomundan toplam RNA izole edilmiş ve spesifik primerler vasıtasıyla çoğaltılarak pHO1 sinyal sekans bölgesine sahip pHIL-S1 vektörüne aktarılmıştır. PZR yöntemi ile 918 baz çiftlik LeExp1 geninin vektör içerisindeki varlığı tespit edilmiş ve hedef geni taşıyan pHIL-S1 vektörü çoğaltılarak Pichia pastoris SMD1168 suşuna elektroporasyon yolu ile transfer edilmiştir. Transgenik P. pastoris SMD1168 suşundan ekspresyon yolu ile ekspanzin proteini üretilmiş ve ekspresyon sonunda toplam protein konsantrasyonu ile kuru hücre ağırlığı ölçümleri yapılmıştır. SDS-PAGE analizi ile elde edilen proteinin ekspanzin olduğu doğrulanmıştır. Bu çalışmanın sonucunda Pichia pastoris SMD1168  suşu ve pHIL-S1 vektörü kullanılarak rekombinant ekspanzin proteini üretimi gerçekleştirilmiştir. 

Keywords

• Pichia pastoris SMD1168,rekombinat ekspanzin,pHIL-S1,LeExp1

References

1. [1]. Demain, A.L., Vaishnav, P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms, Biotechnology Advances, 27, 297-306, 2009.
2. [2]. Falch, E.A. Industrial enzymes — Developments in production and application, Biotechnology Advances, 9, 643-658, 1991.
3. [3]. Hodgson, J. The changing bulk biocatalyst market. Biotechnology, 12, 289-290, 1994.
4. [4]. McQueen-Mason, S.J., Durachko, D.M., Cosgrove, D.J. Two endogenous proteins that induce cell wall extension in plants. Plant Cell 4, 1425–1433, 1992.
5. [5]. Cosgrove, D.J., Loosening of plant cell walls by expansins. Nature, 407, 321–326, 2000.
6. [6]. Cosgrove, D.J. Cell wall loosening by expansins. Plant Physiology, 118, 333–339, 1998.
7. [7]. Rose, J.K.C., Lee, H.H., Bennett, A.B. Expression of a divergent expansin gene is fruit-specific and ripening regulated. Proc Natl Acad Sci USA, 94:5955–5960, 1997.
8. [8]. Brummell, D.A., Harpster MH, Civello PM, Palys JM, Bennett, AB, Dunsmuir P. Modification of expansin protein abundance in tomato fruit alters softening and cell wall polymer metabolism during ripening. Plant Cell, 11, 2203–2216, 1999.

9. [9]. Harrison, P.E., McQueen-Mason, S.J., Manning, K. Expression of six expansin genes in relation to extension activity in developing strawberry fruit. J Exp Bot 52, 1437–1446, 2001.
10. [10]. Gao, Z., Maurousset, L., Lemoine, R., Yoo, S-D., van Nocker, S., Loescher, W. Cloning, expression, and characterization of sorbitol transporters from developing sour cherry fruit and leaf sink tissues. Plant Physiol 131, 1566–1575, 2003.
11. [11]. Wang, Y., Liang, Z.H., Zhang, Y.S., Yao, S.Y., Xu, Y.G. Human insulin from a precursor overexpressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and a simple procedure for purifying the expression product. Biotechnology Bioengineering, 73: 74–9, 2010.
12. [12]. Laemmlı, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680–685, 1970.
13. [13]. Jahic, M., Rotticci-Mulder, J. C. Modeling of growth and energy metabolism of Pichia pastoris producing a fusion protein. Bioprocess and Biosystems Engineering 24(6):385-393, 2002. [14]. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology, 32: 9-17, 2015.
14. [15]. Qiu, Z., Guo, Y., Bao, X., Hao, J., Sun, G., Peng, B., Bi, W. Expression of Aspergillus niger glucose oxidase in yeast Pichia pastoris SMD1168. Protein Expression Purification, 998-1005, 2016.
15. [16]. Salamin, K., Sriranganadane, D., Léchenne, B., Jousson, O., Monod, M. Secretion of an endogenous subtilisin by Pichia pastoris strains GS115 and KM71. Appl. Environ. Microbiology, 76 (13): 4269–4276, 2010.
16. [17]. Chen, X., Meng, K., Shi, P., Bai, Y., Luo, H., Huang, H., Yuan, T., Yang, P., Yao, B. High-level expression of a novel Penicillium endo- 1.3(4)--d-glucanase with high specific activity in Pichia pastoris. Journal of Industrial Microbiology Biotechnology, 39 (6): 869–876, 2012.
17. [18]. Chahal, S., Wei, P., Moua, P., Park, S.P.J., Kwon, J., Patel, A., Vu, A.T., Catolico, J.A., Tsai, Y.F.T., Shaheen, N., Chu, T.T., Tam, V., Khan, Z., Joo, H.H., Xue, L., Cereghino, J..L., Tsai, J.W., Cereghino, G.P.L. Structural Characterization Of The Α-Mating Factor Prepro-Peptide For Secretion Of Recombinant Proteins İn Pichia Pastoris. Gene, 598: 50-62, 2017.