Hipertermi ve Plazma membranı Ca ATPaz: HT’nin PMCA Üzerinde Herhangi Bir Etkisi Var mı?

Abstract

Giriş ve Amaç:Hipertermi (HT) ile kanser hücrelerini tedavi etme fikri en az 5000 yıl öncesine dayanır. Kanser araştırmalarındaki geçmiş teknolojiler, özellikle derin çekirdekli tümörlerde, tam olarak etkili ve homojen bir ısıtma sağlayamadığından dolayı modern kanser araştırmalarında HT’ye ilgi eksikliğine sebep oldu. Ayrıca, HT'nin kanser hücrelerinde apoptozu indüklediği bilinmektedir. Öte yandan, plazma membranı Ca ATPaz (PMCA), apoptoz yolaklarında önemli bir pompadır. PMCA, hücredeki Ca iyonlarını hücrenin dışına pompalar. Bu çalışmanın amacı HT'nin PMCA kinetik parametrelerine etkisini değerlendirmektir. Yöntem:PMCA üzerinde HT'nin etkisini değerlendirmek için, kırmızı kan hücrelerinin plazma membranı kullandık. Sağlıklı donörden izole edilen insan kırmızı kan hücreleri, termomikser kullanılarak 30 dakika, 60 dakika, 90 dakika, 120 dakika boyunca 37oC, 44oC, 50oC'de ısıtıldı. Eritrositler (39ul) lizis çözeltisi 1,7ml eklendi ve 15 dakika inkübe edildi. İnkübasyon sırasında karışım hafifçe karıştırıldı. Karışım 0°C'de 20 dakika için 17000 xg'de santrifüje tabi tutuldu. Bunlar, 1,7 ml KCl tampon içinde yeniden süspansiyona alınmış ve tekrar santrifüje tabi tutulmuştur. Daha sonra, eritrositlerden hemoglobin çıkarılır. Bundan sonra, 0.4 ml'lik bu boş eritrosit süspansiyonu, Indo 1FF-AM ile 0.1 ml tampon ile karıştırıldı. Bu süspansiyon, buz üzerinde 15 dakika inkübe edildi. Bu boş eritrositler 37°C'de 45 dakika inkübe edilerek tekrar kapatılmış ve kullanıma kadar buz üzerinde depolanmıştır. Sonuçlar:Kalsiyum konsantrasyon seviyelerine göre kontrol ile diğer sıcaklık arasında belirgin farklar vardır. Ayrıca, 37oC ile diğer sıcaklık arasında belirgin bir fark vardır. PMCA 37oC üzerindeki sıcaklıklarda çok iyi çalışmadı. Bu nedenle, yüksek kalsiyum konsantrasyonu ölçüldü. Pompa düzgün bir şekilde çalışıyorsa, kalsiyum konsantrasyon seviyesi zamanla azalacaktır. Aksine, eritrosit keseciklerinde artan kalsiyum konsantrasyon seviyeleri ölçtük. HT’ye maruz kalan PMCA, yüksek sıcaklıktan etkilenir ve PMCA çalışmaz, böylece Ca iyonları hücrelerden dışarı çıkamaz. Hücre ölümü ısının etkisi ile bozulan PMCA kinetiğinden dolayı tetiklenmektedir.

Keywords

• PMCA,Ca görüntüleme,Hipertermi

Hyperthermia and Plasma Membrane Ca ATPase: Is There Any Effect of HT on PMCA?

Abstract

Introduction and Aim: The idea of treating cancer cells with hyperthermia (HT) is based on at least 5000 years back. Past technologies in cancer research could not deliver effective and homogenous heating to all cites, especially in deep-seeded tumors. This is the main reason for lack of interest in modern cancer research. Also, HT is known to induce apoptosis in cancer cells. On the other hand, Plasma membrane Ca ATPase (PMCA) is an important pump in apoptosis pathways. PMCA pumps Ca ions in the cell to the outside of the cell. The aim of the present study is to evaluate the effect of HT in the kinetic parameters of PMCA. Materials and Methods:To evaluate the effect of HT in PMCA, we used red blood cells plasma membrane. Human red blood cells which isolated from the healthy donor were heated at control, 37oC, 44oC, 50oC during 30min, 60min, 90min, 120min by using thermomixer. 1,7ml Lysis solution were added to Erythrocytes (39ul) and incubated for 15 minutes. During the incubation, the mix was gently stirred. The mix was centrifuged at 17000xg for 20 minutes at 0oC. They were resuspended in 1,7ml KCl buffer and centrifuged again. Then, hemoglobin removed from erythrocytes. After that, 0.4ml of this empty erythrocytes suspension was mixed with 0.1ml buffer with Indo 1FF-AM. This suspension was incubated for 15min on ice. These empty erythrocytes were resealed by incubation at 37°C for 45 min and stored on ice until use. Results:According to calcium concentration levels, there are significant differences between 0oC and the other temperatures. Also, there is a significant difference between 37oC and the other temperatures. PMCA did not work very well at the temperatures over 37oC. So we measured high concentration levels of calcium in the erythrocytes. Conclusion:If the pump worked properly, we had to see decreasing concentration levels of calcium with time. On the contrary, we measured growing concentration levels of calcium in the erythrocytes. Then, HT effects to PMCA and when PMCA does not work, Ca ions cannot go out from the cells. As a result, calcium overloading is one of the consequences of apoptosis.  

Keywords

• PMCA,Ca imaging,Hyperthermia

References

1. 1. Ahmed K, Tabuchi Y, Kondo T. Hyperthermia: an effective strategy to induce apoptosis in cancer cells. Apoptosis. 01 Kasım 2015;20(11):1411–9. 2. L-G LFF. Pathological Effects of Hyperthermia in Normal Tissues. Cancer Res. 01 Ekim 1984;44(10 Supplement):4826s–4835s. 3. Richter K, Haslbeck M, Buchner J. The Heat Shock Response: Life on the Verge of Death. Mol Cell. 22 Ekim 2010;40(2):253–66. 4. Bruce JIE. Metabolic regulation of the PMCA: Role in cell death and survival. Cell Calcium. 08 Haziran 2017; 5. Lew VL, Daw N, Perdomo D, Etzion Z, Bookchin RM, Tiffert T. Distribution of plasma membrane Ca2+ pump activity in normal human red blood cells. Blood. 01 Aralık 2003;102(12):4206–13. 6. Kubitscheck U, Pratsch L, Passow H, Peters R. Calcium pump kinetics determined in single erythrocyte ghosts by microphotolysis and confocal imaging. Biophys J. Temmuz 1995;69(1):30–41. 7. Shaklai N, Yguerabide J, Ranney HM. Interaction of hemoglobin with red blood cell membranes as shown by a fluorescent chromophore. Biochemistry (Mosc). 13 Aralık 1977;16(25):5585–92. 8. Strehler EE, Zacharias DA. Role of alternative splicing in generating isoform diversity among plasma membrane calcium pumps. Physiol Rev. Ocak 2001;81(1):21–50.