Database Selection Shapes Protein Identification and Quantification in Proteomics

Öz

Objective: This study evaluates the effect of protein database composition, size, and subcellular specificity on protein identification, peptide coverage, and quantitative accuracy in MS-based proteomic analyses. Methods: Whole proteome analyses were performed using HeLa cells. Label-free quantification (LFQ) analyses of secretome samples were conducted using the breast cell lines MCF-10A and MDA-MB-231 to assess database-related effects on quantification. Nuclear proteome analyses were carried out using raw MS data generated in previous studies. Reviewed, unreviewed, and subcellular proteome–specific databases were systematically analyzed and compared to evaluate the effect of database on LC-MS/MS results. Results: Using unreviewed protein entries did not result in a meaningful increase in protein or peptide identifications. Results showed that using gene name provided more accurate results comparing with accession number. In addition, subcellular proteome–specific databases improved peptide-to-protein assignment consistency and reduced ambiguity. Even modest differences in peptide counts propagated into downstream quantitative analyses, affecting abundance ratios. Conclusion: Results indicate that database choice plays a crucial role in proteomic data clarity, consistency, and quantitative reliability, and that the use of curated, reviewed, and target-specific subcellular databases enhances analytical confidence, emphasizing the importance of careful database selection in MS-based proteomic studies.

Anahtar Kelimeler

• Proteomics
• LC-MS/MS analysis
• Database selection
• Protein identification
• Quantitative proteomics

Proteomikte Veri Bankası Seçimi, Protein Tanımlama ve Kantifikasyonu Şekillendirir

Öz

Amaç: Bu çalışma, MS tabanlı proteomik analizlerde protein tanımlama, peptit kapsamı ve nicel doğruluk üzerindeki protein veri tabanı bileşimi, boyutu ve hücre altı özgüllüğünün etkisini değerlendirmektedir. Yöntem: HeLa hücreleri kullanılarak tüm proteomik analizler gerçekleştirilmiştir. Veri bankası seçiminin miktar tayini analizleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek amacıyla, MCF-10A ve MDA-MB-231 meme hücre hatları kullanılarak sekretom analizleri yapılmıştır. Nükleer proteom analizleri, önceki çalışmalarda üretilen ham MS verileri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gözden geçirilmiş (reviewed), gözden geçirilmemiş (unreviewed) ve hücre altı proteomuna özgü veri bankaları sistematik olarak analiz edilmiş ve veritabınının LC-MS/MS sonuçları üzerindeki etkisini değerlendirmek için karşılaştırılmıştır. Bulgular: Gözden geçirilmemiş protein verilerinin kullanılmasının, protein ve peptit tanımlamalarında anlamlı bir artış sağlamadığı belirlenmiştir. Sonuçlar, protein analizlerinde gen isimlerinin kullanımının erişim (Accession) numaralarına kıyasla daha doğru sonuçlar verdiği göstermiştir. Ayrıca, hücre altı proteomuna özgü veri tabanları kullanımı, peptit ve protein belirlenmesi süreçlerinde güvenilirliği artırmış ve belirsizliği azaltmıştır. Peptit sayılarındaki görece küçük farklılıkların bile, sonraki nicel analizlere yansıyarak yoğunluk ve bulunma oranlarını etkilediği saptanmıştır. Sonuç: Sonuçlar, veri bankası seçiminin proteomik verilerin şeffaflığı, tutarlılığı ve nicel güvenilirliği açısından kritik bir rol oynadığını göstermektedir. Düzenlenmiş, gözden geçirilerek doğrulanmış ve hedefe yönelik hücre altı veri bankalarının kullanımı, analitik güveni artırdığı ve kütle spektrometrisi tabanlı proteomik çalışmalarda doğru veri bankasının seçiminin önemini ortaya konulmuştur.

Anahtar Kelimeler

• Proteomik
• LC-MS/MS analizi
• Veri tabanı seçimi
• Protein tanımlama
• Kantitatif proteomik

Kaynakça

1. NK, Thu NQ, Tien NTN, Long NP, Nguyen HT. Advancements in Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics and Lipidomics: Implications for Clinical Research. Molecules. 2024;29:24. doi:10.3390/molecules29245934.
2. Sidira M, Agriopoulou S, Smaoui S, Varzakas T. Omics-Integrated Approach (Metabolomics, Proteomics and Lipidomics) to Assess the Quality Control of Aquatic and Seafood Products. Applied Sciences. 2024;14:22-10755. doi:10.3390/app142210755.
3. Xu W, Kang J, Rosing T. A near-storage framework for boosted data preprocessing of mass spectrum clustering. J Proteome Res. 2022:313–318. doi:10.1145/3489517.3530449
4. Chen C, Hou J, Tanner JJ, Cheng J. Bioinformatics Methods for Mass Spectrometry-Based Proteomics Data Analysis. Int J Mol Sci. 2020;21:8-2873. doi:10.3390/ijms21082873
5. Swaney DL, Villén J. Proteomic Analysis of Protein Posttranslational Modifications by Mass Spectrometry. Cold Spring Harb Protoc. 2016;2016(3):pdb.top077743. doi:10.1101/pdb.top077743
6. Gao Y, Wang Y. A method to determine the ionization efficiency change of peptides caused by phosphorylation. J Am Soc Mass Spectrom. 2007;18(11):1973-6. doi:10.1016/j.jasms.2007.08.010
7. Fancello L, Burger T. An analysis of proteogenomics and how and when transcriptome-informed reduction of protein databases can enhance eukaryotic proteomics. Genome Biol. 2022;23(1):132. doi:10.1186/s13059-022-02701-2
8. McAfee KJ, Duncan DT, Assink M, Link AJ. Analyzing proteomes and protein function using graphical comparative analysis of tandem mass spectrometry results. Mol Cell Proteomics. 2006;5(8):1497-1513. doi:10.1074/mcp.T500027-MCP200

9. Reiter L, Claassen M, Schrimpf SP, et al. Protein identification false discovery rates for very large proteomics data sets generated by tandem mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 2009;8(11):2405-17. doi:10.1074/mcp.M900317-MCP200
10. Jadot M, Boonen M, Thirion J, et al. Accounting for Protein Subcellular Localization: A Compartmental Map of the Rat Liver Proteome. Mol Cell Proteomics. 2017;16(2):194-212. doi:10.1074/mcp.M116.064527
11. Ota M, Gonja H, Koike R, Fukuchi S. Multiple-Localization and Hub Proteins. PLoS One. 2016;11(6):e0156455. doi:10.1371/journal.pone.0156455
12. Rencber SF, Yazır Y, Sarıhan M, et al. Endoplasmic reticulum stress of endometrial mesenchymal stem cells in endometriosis. Tissue and Cell. 2024;91:102544. doi:10.1016/j.tice.2024.102544
13. Sarihan M, Özen FZ, Kasap M, Akpinar G. A tetracycline-inducible Split TurboID system for specific biotinylation and identification of nuclear proteins from HEK293T cells. Turk J Biol. 2025;49(2):162-174. doi:10.55730/1300-0152.2734
14. Sarihan M, Kasap M, Akpinar G. Streamlined Biotinylation, Enrichment and Analysis for Enhanced Plasma Membrane Protein Identification Using TurboID and TurboID-Start Biotin Ligases. J Membr Bio. 2024;257(1-2):91-105. doi:10.1007/s00232-023-00303-y
15. Kumar D, Yadav AK, Dash D. Choosing an Optimal Database for Protein Identification from Tandem Mass Spectrometry Data. Methods Mol Biol. 2017;1549:17-29. doi:10.1007/978-1-4939-6740-7_3
16. Zhang Y, Fonslow BR, Shan B, Baek MC, Yates JR, 3rd. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 2013;113(4):2343-94. doi:10.1021/cr3003533