A Study on the Integration of In Vitro Methods with In Vivo Double Haploid Technique in Maize (Zea mays L.)

Öz

The in vivo doubled haploid technique in maize breeding significantly reduces the time required for developing homozygous lines, offering advantages in terms of both time and cost. Although this technique enables the development of lines much faster than traditional breeding methods, ongoing research aims to further shorten the development process through alternative approaches. In this context, significant efforts have been devoted to integrating in vitro methods with in vivo doubled haploid technique. This study aimed to investigate the potential of combining in vivo and in vitro techniques for the rapid development of homozygous maize lines. A total of 10 local populations and 3 inducer lines (CIM2GTAIL-P2, ADAIL-1, STOCK-6) were used as experimental material. The study was conducted in two phases under field and laboratory conditions. During the first phase, induction crosses were performed in 2022, and the haploid induction rates of donor genotypes were found to range from 1.29% to 7.12%, as determined using the Navajo marker. In the laboratory phase, immature embryo culture was employed for both direct and indirect regeneration using samples collected 18–20 days after induction crossing. Haploid status of the samples obtained through direct regeneration was confirmed using the Feulgen chromosome staining method. Four of the donor materials (DON3, DON4, DON6, DON7) yielded successful results in tissue culture studies. Explants were taken from immature embryos to CHU medium for callus formation and then these calli were transferred to Murashige and Skoog medium for the formation of somatic embryos. This approach enabled the production of 3 to 6 calluses per immature embryo, depending on the donor genotype. The results of this study indicate that integrating immature embryo culture as an in vitro method into the in vivo doubled haploid technique can offer benefits in terms of both time efficiency and an increased number of developed materials.

Anahtar Kelimeler

• Zea mays
• callus
• haploid induction rate
• embryo
• homozygous
• tissue culture

Mısırda (Zea mays L.) In vivo Katlanmış Haploid Tekniğine In vitro Yöntemlerin Entegrasyonu Üzerine Bir Çalışma

Öz

Mısır ıslahında kullanılan in vivo katlanmış haploid yöntemi, homozigot hatların geliştirilme süresini önemli ölçüde kısaltarak ıslah programlarına hem zaman hem de maliyet açısından avantaj sağlamaktadır. Klasik yöntemlere kıyasla daha kısa sürede hat elde edilmesine olanak tanıyan bu yöntem, geliştirme sürecinin daha da hızlandırılabilmesi için farklı stratejilerle desteklenmektedir. Bu bağlamda, in vitro yöntemlerin in vivo haploid tekniklerine entegre edilmesi üzerine yoğun bir araştırma yürütülmektedir. Bu çalışmada, in vivo ve in vitro yöntemlerin bir arada uygulanmasıyla kısa sürede homozigot mısır hatlarının geliştirilme potansiyeli incelenmiştir. Araştırmada, 10 yerel popülasyon ve 3 indirgeyici hat (CIM2GTAIL-P2, ADAIL-1, STOCK-6) donör materyal olarak kullanılmıştır. Denemeler, tarla ve laboratuvar koşullarında iki aşamalı olarak gerçekleştirilmiştir. İlk aşamada, 2022 yılında indüksiyon melezlemeleri yapılmış ve Navajo markörüne göre değerlendirilen donör hatların indirgenme oranları %1,29 ile %7,12 arasında değişmiştir. Laboratuvar aşamasında, indüksiyon melezlemesinden 18-20 gün sonra alınan örnekler kullanılarak olgunlaşmamış embriyo kültürü yöntemiyle hem doğrudan hem de dolaylı rejenerasyon sağlanmıştır. Doğrudan rejenerasyon yoluyla elde edilen örneklerin gerçek haploid oldukları, Feulgen kromozom boyama yöntemiyle doğrulanmıştır. Çalışmada kullanılan donör materyallerden dört tanesi (DON3, DON4, DON6, DON7), doku kültürü aşamalarında başarılı sonuçlar vermiştir. Olgunlaşmamış embriyolardan kallus oluşumu için CHU besi ortamına eksplantlar alıınmış sonrasında bu kallıuslardan somatik embriyoların oluşması için eksplantlar MS ortamına transfer edilmiştir. elde edilerek somatik embriyolar oluşturulmuş ve bu embriyolar alt kültürlere aktarılmıştır. Bu yöntemle, bir embriyodan tür özelliklerine bağlı olarak 3 ila 6 arasında klon bitki üretilebilmiştir. Araştırma sonuçları, in vivo haploid tekniğine olgunlaşmamış embriyo kültürünün entegre edilmesinin zaman tasarrufu sağladığını ve geliştirilen materyal miktarını artırdığını ortaya koymuştur.

Anahtar Kelimeler

• Zea mays
• kallus
• haploid indirgeme oranı
• embriyo
• homozigot
• doku kültürü

Kaynakça

1. Anonim. 2022. https://www.tarimorman.gov.tr/ TAGEM/Belgeler/ yayin/TOPRAKSU%20GÜBRE%20TAVSİYE%20%20Verileri.pdf. Available date 01.12.24.
2. Barnabás, B. B. Obert, and G. Kovacs. 1999. Colchicine, an efficient genome-doubling agent for maize (Zea mays L.) microspores cultured in anthero. Plant cell reports. 18: 858-862. https://doi.org/10.1007/s002990050674
3. Barnabás, B., P. L. Pfahler, and G. Kovacs. 1991. Direct effect of colchicines on the microspore embryogenesis to produce dihaploid plants in wheat (Triticum aestivum L). Theoretical and Applied Genetics 81: 675–6.78.
4. Cengiz, R. and K.Z. Korkut. 2016. Development of doubled haploid maize lines by using in vivo haploid technique. Biotech Studies 29(1): 1-7.
5. Cerit, I., G. Cömertpay, R. Oyucu, B. Çakır, R. Hatipoğlu, and H. Özkan. 2016. Determination of haploid induction rates of different inducer lines used. Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsü Dergisi. 25 (özel sayı-1): 52-57.
6. Chu C.C, W.C. Chu, S.C. San, H. Chen, Y.K. Chu, C.C. Yin 1975. Establishment of an efficient medium for anther culture ofrice through comparative experiments on the nitrogen source. Sci. Sinica 18: 659–668.
7. Dwivedi, S. L., A. B. Britt, L. Tripathi, S. Sharma, H.D. Upadhyaya, and R. Ortiz. 2015. Haploids: constraints and opportunities in plant breeding. Biotechnology Advances. 33 (6): 812-829.
8. Eder, J., and S. Chalyk. 2002. In vivo haploid induction in maize. Theoretical and Applied Genetics 104: 703-708.

9. FAO. 2024. Food and Agriculture. Available at: https://www.fao.org/faostat/en/#home (Available date 13.02.24).
10. Furini, A. and C. Jewell. 1995. Somatic embryogenesis and plant regeneration of maize, Tripsacum hybrids. Maydica 40 (2): 205-210.
11. Hu, G. 2014. Study on haploid induction rates in different maize inducers. Agricultural Science Technology 15(4):554-556.
12. Kahrıman, F., A. Kahrıman, A.M. Güz, and N.N Yüksel, 2022c. Development of homozygous maize lines differing in oil and zein content using in-vivo maternal haploid technique. Biotech Studies. 31 (2):79-86.
13. Kahrıman, F., C.Ö. Egesel, and A. Demir. 2013. Türkiye’de mısır ıslahı çalışmalarının geçmişi ve bugünü. Türkiye 10. Tarla Bitkileri Kongresi. 10-13 Eylül, Konya, Bildiriler Kitabı. 1: 545-550.
14. Kahrıman, F., Ş. Erdal. and C.Ö. Egesel. 2022a. Mısırda Tane Kalitesi s. 131-156 In: R. Cengiz (Ed). MISIR, Islah Teknikleri ve Yetiştiriciliği.İKSAD Yayınevi, Adıyaman. Türkiye.
15. Kahrıman, F., U. Songur, A. Dişbudak, S. Kızık and B. Vural. 2022b. Effects of donor x inducer ınteraction on the success of haploid ınduction and comparison of haploid seed identification methods in the in vivo maternal haploid technique in maize. Journal of Agricultural Sciences. 28 (3): 385-395.
16. Lashermes, P. and M. Beckert, 1988. Genetic Control of maternal haploidy in maize (Zea mays L.) and selection of haploid inducing lines. Theoretical and Applied Genetics. 76:405-410.
17. Maluszynska, J. 2003. Cytogenetic tests for ploidy level analyseschromosome counting. pp. 391-395. In: Doubled Haploid Production in Crop Plants: A Manual. Dordrecht: Springer Netherlands.
18. Murashige, T. and Skoog 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473–479
19. Petersen, K., K, P. Hagberg, and K. Kristiansen. 2002. In vitro chromosome doubling of Miscanthus sinensis. Plant Breeding 121: 445– 450.
20. Prasanna, B. M., V. Chaikam, and G. Mahuku. 2012. Doubled Haploid Technology in Maize Breeding: Theory and Practice. Mexico D.F., CIMMYT.
21. R Core Team. 2019. R: A language and environment for statistical computing, R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. 2019. Acesses at: https://www.R-project.org/
22. Rueden, C. T., J. Schindelin, M.C. Hiner, B.E. DeZonia, A.E. Walter, E.T. Arena and K.W. Eliceiri, 2017. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18: (529) 1-26.
23. Taşkın, S. Z. 2023. In vivo katlanmış haploid tekniği ile mısır genotiplerinin (Zea mays L.) geliştirilmesi. Yayınlanmamış Doktora tezi. Bursa Uludağ Üniversitesi. Fen Bilimleri Enstitüsü, Bursa.
24. Türkmen, O. S., Z. Karaceylan, M. Küçük and R. C. Beram. 2023. Effective Contamination agent for tissue culture applications of Bacopa monnieri. Bilge International Journal of Science and Technology Research. 7(2) : 172-176.
25. TURKSTAT. 2020. Available at: https://data.tuik.gov.tr (Acesses date: 12.05.2021).
26. Wan, Y., J. F. Petolino, and J. M. Widholm,1989. Efficient production of doubled haploid plants through colchicine treatment of anther-derived maize callus. Theorettical and Applied Genetics 77(6): 889-892.