Farklı DNA İzolasyon Yöntemlerinin Miktar ve Kalite Üzerine Etkilerinin Belirlenmesi

Öz

Amaç: Bu çalışmanın amacı, farklı DNA ekstraksiyon yöntemlerinin (CTAB, fenol-kloroform, silika kolonlar, manyetik boncuklar) mısır (Zea mays L.), fasulye (P. vulgaris L.), meşe (Q. robur L.) ve sarıçamdan (P. sylvestris L.) elde edilen DNA verimi ve saflığı üzerindeki etkilerinin karşılaştırılmasıdır. Materyal ve Yöntem: Bu çalışmada, mısır, fasulye, meşe ve sarıçam türlerine ait genç apikal yapraklar (bitkinin en uç kısmındaki tam olarak gelişmiş yapraklar) kullanılmıştır. Her bir türden, 2024 vejetasyon dönemi süresince Çanakkale ilinin Bayramiç ilçesinde yer alan farklı lokasyonlarındaki bitki plantasyonlarına ait genç apikal yapraklardan 10 adet yaprak doku örneği toplanmıştır. DNA izolasyonu, CTAB, fenol-kloroform, silika bazlı kolonlar ve manyetik boncuklar olmak üzere dört farklı yöntem kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu yöntemler, her bir bitki türü için genetik analizlere uygunlukları açısından karşılaştırılmıştır. Bulgular: Fenol-kloroform yöntemi kullanılarak P. sylvestris L. örneklerinden oldukça yüksek düzeyde DNA verimi elde edilmiştir (371.75 ng/µL). Benzer şekilde, Q. robur L. türü de yüksek bir DNA verimi (352.00 ng/µL) göstermiştir. Bu durum, her iki türün de özellikle bu yöntemle yüksek uyum sağladığını ortaya koymaktadır. CTAB yöntemi de başarılı sonuçlar vermiştir. P. sylvestris L., bu yöntemle 323.75 ng/µL DNA verimi göstererek CTAB yöntemine genetik materyal açısından oldukça uyumlu olduğunu kanıtlamıştır. Q. robur L. için elde edilen DNA verimi ise 308.00 ng/µL olup, bu sonuç protein uzaklaştırma için ek adımlar gerekebileceğine işaret etmektedir. Silika kolon yöntemi ile elde edilen DNA verimleri, genellikle diğer üç yöntemle karşılaştırıldığında daha düşük kalmıştır. Bu yöntemde, P. sylvestris L. için 230.75 ng/µL, Q. robur L. için ise 222.25 ng/µL DNA verimi kaydedilmiştir. Zea mays L. türünde 211.75 ng/µL DNA verimi gözlenirken, P. vulgaris L. türünde bu değer 171.75 ng/µL olarak ölçülmüştür. Düşük DNA verimi, silika kolonlarının sınırlı bağlama kapasitesinden ya da yetersiz başlangıç materyalinden kaynaklanmış olabilir. Manyetik boncuk yöntemi ile elde edilen DNA verimleri ise tüm yöntemler arasında en düşük seviyelerde kalmıştır. Bu yöntemde; P. sylvestris L. için 206.25 ng/µL, Q. robur L. için 201.75 ng/µL, Zea mays L. için 173.50 ng/µL ve P. vulgaris L. için 151.75 ng/µL DNA verimleri kaydedilmiştir. Sonuç: Bu çalışmada Z. mays L., P. vulgaris L., Q. robur L. ve P. sylvestris L. türleri için CTAB, fenol-kloroform, silika kolonlar ve manyetik boncuklar gibi farklı DNA izolasyon yöntemleri karşılaştırılmıştır. Elde edilen bulgular, DNA verimi ve saflığındaki farklılıkların bitki türlerine ve doku özelliklerine bağlı olduğunu ortaya koymaktadır. Tüm bitki türlerinde en yüksek DNA verimi ve saflığı fenol-kloroform yöntemi ile elde edilmiştir. Bu yöntem proteinler, polisakkaritler ve fenolik bileşiklerden arındırılmış DNA izolasyonu sağlayarak yüksek moleküler bütünlükte DNA elde edilmesine olanak tanımaktadır. Sonuçlar, lignin ve fenolik bileşikler açısından zengin olan Q. robur L. ve P. sylvestris L. türlerinin en yüksek DNA verimine sahip olduğunu ve moleküler bütünlüğün korunduğunu göstermektedir. Bu durum, yüksek kaliteli DNA gerektiren moleküler analizler için fenol-kloroform yönteminin tercih edilmesini desteklemektedir.

Anahtar Kelimeler

• DNA izolasyonu
• CTAB
• fenol-kloroform
• silika kolonları
• manyetik boncuklar

Determination of the Effects of Different DNA Isolation Methods on Quantity and Quality

Abstract

Objective: This study compared the effects of different DNA extraction methods (CTAB, phenol-chloroform, silica columns, magnetic beads) on the DNA yield and purity obtained from maize (Zea mays L.), bean (P. vulgaris L.), oak (Q. robur L.) and scots pine (P. sylvestris L.). Materials and Methods: In this study, young apical leaves (the most distal fully expanded leaves) of maize, bean, oak and scots pine were used. For each species, 10 leaf tissue samples were collected from young apical leaves during the vegetation season of the year 2024 from plantations located at different sites within the Bayramiç district of Çanakkale province. Leaf tissue samples were collected during the vegetation season of the year 2024, specifically during the early phenological stages of each species. For maize and bean, samples were obtained in the early vegetative growth phase, when the apical leaves were fully expanded but still young and metabolically active. For oak and Scots pine, sampling was conducted during the early spring, shortly after bud burst, when newly emerged apical leaves were in the initial phase of leaf expansion. Young apical leaves were preferred as they contain fewer secondary metabolites and phenolic compounds, which can interfere with DNA extraction and downstream molecular applications. This sampling strategy ensured the collection of high-quality tissue suitable for genomic DNA isolation. DNA isolation was performed using four different methods: CTAB, phenol-chloroform, silica-based columns, and magnetic beads. These methods were compared in terms of their suitability for genetic analyses specific to each plant species. Results: Using the phenol-chloroform method, a notably high DNA yield was obtained from P. sylvestris L. samples (371.75 ng/µL). Similarly, Q. robur L. also exhibited high yield (352.00 ng/µL), suggesting that these species are particularly compatible with this method. The CTAB method also yielded successful results. P. sylvestris L. achieved a high DNA yield (323.75 ng/µL), indicating that this species' genetic material is compatible with the CTAB method. A DNA yield of 308.00 ng/µL was observed for Q. robur L., which may necessitate additional steps for protein removal. The silica column method yielded DNA samples of a lower quantity than the other three methods. For P. sylvestris L. and Q. robur L., yields of (230.75 ng/µL) and (222.25 ng/µL), respectively, were recorded. Lower yields were observed in P. vulgaris L. (171.75 ng/µL) compared to Zea mays L. (211.75 ng/µL). The diminished DNA recovery may be attributable to the constrained binding capacity of silica columns or inadequate initial material. In the magnetic beads method, DNA yields for P. sylvestris L. (206.25 ng/µL), Q. robur L. (201.75 ng/µL), Zea mays L. (173.50 ng/µL) and P. vulgaris L. (151.75 ng/µL) were the lowest among all methods. Conclusion: This study compares DNA isolation methods including CTAB, phenol-chloroform, silica columns, and magnetic beads for Zea mays L., P. vulgaris L., Q. robur L., and P. sylvestris L. The findings reveal that the differences in DNA yields and purity depend on the plant species and tissue characteristics. The phenol-chloroform method provided the highest DNA yields and purity across all plant species. This method excels in obtaining DNA free from proteins, polysaccharides, and phenolic compounds, ensuring high molecular integrity. The results demonstrate that Q. robur L. and P. sylvestris L., which are rich in lignin and phenolic compounds, had the highest yields and preserved molecular integrity. This supports the use of the phenol-chloroform method in molecular analyses requiring high-quality DNA.

Keywords

• DNA isolation
• CTAB
• Phenol-chloroform
• Silica columns
• Magnetic beads

Kaynakça

1. Akbulut, H.M. (2024). Hücre dışı DNA izolasyonlarında belirli parametrelerin optimizasyonu. (Master's thesis). Kırşehir Ahi Evran Üniversitesi-Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, ss.57.
2. Aljanabi, SM. & Martinez, I. (1997). Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acids Research, 25(22), 4692-4693.
3. Cetinkaya, R. & Aysan, Y. (2022). Doğu Akdeniz bölgesinde yetişen mısır (Zea mays) bitkisinin yeni bir bakteriyel hastalığı: Dickeya zeae’nın neden olduğu bakteriyel sap çürüklüğü. Mustafa Kemal University Journal of Agricultural Sciences/Mustafa Kemal Universitesi Tarim Bilimleri Dergisi, 27(3), 493-501.
4. Deka, P.C. (2024). Gene cloning. In Research Anthology on Bioinformatics, Genomics and Computational Biology, 650-689. IGI Global.
5. Dogdu, E.M. (2025). Türkiye’de yayılış gösteren pinus türlerine özgü bir dna izolasyon protokolü geliştirilmesi (Doctoral dissertation), Harran Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, ss.94
6. Doyle, J.J. & Doyle, J.L. (1987). A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical bulletin, 19, 11-15.
7. Du, X., Lu, M., Lan, H., Cai, Z., Pan, D. & Wu, Y. (2024). Development of a high-throughput DNA isolation method for livestock and poultry meat based on mesoporous metal-organic framework-coated solid-phase microextraction device. Journal of Food Composition and Analysis, 127, 105977.
8. Dutta, M., Sharma, P., Raturi, V., Bhargava, B. & Zinta, G. (2024). SarCTAB: An efficient and cost-effective DNA isolation protocol from geophytes. 3 Biotech, 14(2), 36.

9. Fopp-Bayat, D., Raczyński, T. & Kuciński, M. (2024). Applicability of an in-house Chelex-100 DNA isolation method for extracting genetic material from sterlet embryos. Fisheries & Aquatic Life, 32(1), 1-8.
10. Guldur, M., Dikilitaş, M., Kılınç, B. & Şimşek, E. (2024). Şanlıurfa peyzaj alanlarında çam ağaçlarında sürgün kurumalarına ve geriye doğru ölümlere neden olan Alternaria alternata etmeninin Türkiye’deki ilk kaydı. Mustafa Kemal Üniversitesi Tarım Bilimleri Dergisi, 29(1), 212-223.
11. Jablonski, B., Meier, NA., Chatwin, W., Coggeshall, MV., Romero-Severson, J. & Revord, RS. (2024). Quantitative trait loci for bearing habit in a ‘Sparrow’בSchessler’Juglans nigra mapping population. Tree Genetics & Genomes, 20(5), 30.
12. Kiy, D. & Akpulat, H.A. (2024). Yüksek oranda fenolik bileşen içeren Thymus (Lamiaceae) türlerinin modifiye edilmiş CTAB yöntemiyle genomik DNA izolasyonu. Turkish Journal of Biodiversity, 7(1), 11-16.
13. Lefort, F. & Douglas, G. C. (1999). An efficient micro-method of DNA isolation from mature leaves of four hardwood tree species Acer, Fraxinus, Prunus and Quercus. Annals of Forest Science, 56(3), 259-263.
14. Murray, M.G. & Thompson, W. (1980). Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic acids research, 8(19), 4321-4326.
15. Pandit, S.S., Mitra, S.S., Giri, A.P. & Gupta, V.S. (2007). A quick method for isolating rna from raw and ripe fleshy fruits as well as for co-isolating DNA and RNA from polysaccharideand polyphenol-rich leaf tissues. Journal of Plant Biology, 50, 60-64.
16. Rehman, A., Khan, I. & Farooq, M. (2024). Secondary metabolites mediated reproductive tolerance under heat stress in plants. Journal of Plant Growth Regulation, 43(9), 2993-3011.
17. Rezvantseva, Y., Zybin, D., Prostyakova, A., Oleinikov, V. & Kapustin, D. (2024). Sorption properties of pristine and functionalized magnetic carbon nanotubes in relation to double-stranded DNA. Journal of Biotechnology, 385, 13-22.
18. Saghai-Maroof, M.A., Soliman, K.M., Jorgensen, R.A. & Allard, R. (1984). Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences, 81(24), 8014-8018.
19. Sahu, S.K., Thangaraj, M. & Kathiresan, K. (2012). DNA extraction protocol for plants with high levels of secondary metabolites and polysaccharides without using liquid nitrogen and phenol. International Scholarly Research Notices, 2012(1), 205049.
20. Tatar, M., Bildirici, A.E., Ölmez, F., Mustafa, Z. & Tozlu, G. (2024). Eski ve yeni böcek örneklerinde farklı DNA izolasyon protokollerinin karşılaştırılması. Journal of the Institute of Science & Technology/Iğdır Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 14(2), 135-148.
21. Toader, V.A., Moldovan, I.C., Sofletea, N., Abrudan, I.V. & Curtu, AL. (2010). DNA isolation and amplification in oak species (Quercus spp.). Bulletin of the Transilvania University of Brasov. Series II: Forestry Wood Industry Agricultural Food Engineering, 45-50.
22. Torres, S., Dailey, Y. & White, K. (2021). Application of biomedical molecular techniques in environmental sciences. Practical Applications of Medical Geology, 287-317.