Autologous Serum for Expansion of Human Bone Marrow Derivated Mesenchymal Stem Cell

Abstract

Objective: Mesenchymal stem cells (MSC), mostly derivated from bone marrow, are capable of differentiating into many tissues. In the culture medium consisting of 10% fetal bovine serum (FBS), MSCs can grown easily. To obtain insights into their ex-vivo expansion, the role of the autologous serum (OS) on growth and differentiation capacity of human bone marrow MSCs in comparison to cells grown in FBS was studied. Material and Methods: MSCs were cultured by using a RPMI-1640 medium consisting of 10% FBS, and OS 10%, 5%, 3% and 1%. Equally, 1x106/mL cells were incubated into each flask. Cell count, viability, and flow cytometry studies were done at every passage after completing detachment in the cultures. Results: 10% OS group was found to be superior compared to the other study groups as regard to cell count and isolation. In addition, it has been observed that similar resuts were found in 5% OS and 10% FBS groups. Immunophenotyping analysis of the cells revealed no statistical difference between the groups. MSCs isolated from all study groups were successfully differentiated into adipogenic lineages except 3% and 1% OS groups. Conclusion: The expansion potency from bone marrow-derived MSCs was maintained in culture media using 10% and 5% OS. Turkish Başlık: İnsan Kemik İliği Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerin Otolog Serum ile Kültüre Edilmesi Anahtar Kelimeler: Mezenkimal kök hücre; otolog serum; kemik iliği; fetal buzağı serum Amaç: Mezenkimal kök hücreler (MKH) en sık kemik iliğinden elde edilen ve bir çok dokuya farklılaşma yeteneğine sahip çok yönelimli öncü hücrelerdir. MKH'ler %10 fetal bovin serumlu (FBS) besiyerinde üretilirler. Bu çalışmada amaç FBS'un olası risklerinden uzaklaşılması için otolog serum kullanarak klinik kullanım için uygun MKH üretimini sağlamaktır. Gereç ve Yöntemler: Yaşları 28-34 arasında değişen 10 kemik iliği donoründen yazılı onamları alınarak 10 mL kemik iliği ve 500 mL periferik kan örneği alındı. Kemik iliğinden fikol yoğunluk derecelendirme yöntemiyle mononükleer hücreler izole edildi. Eşit sayıda hücre (1x106/mL) RPMI-1640 medium kullanılarak %10 FBS, otolog serum (OS), %10, %5, %3 ve %1 konsantrasyonlarında kültüre edildi. Her pasaj arasında morfolojik değerlendirme, hücre sayımı ve akım sitometrik yöntemler kullanılarak immunfenotipik analizler yapıldı. Üçüncü pasaja ulaşan gruplarda yağ dokusuna farklılaştırma gerçekleştirildi. Bulgular: Hücre sayımı ve izolasyon açısından en iyi grubun %10 OS grubu olduğu gösterildi. Buna ilave olarak %5 OS ve %10 FBS gruplarındaki sonuçların benzer olduğu gözlemlendi. Akım sitometrik sonuçlar değerlendirildiğinde gruplar arasında istatistiksel fark yoktu. Yağ dokusuna farklılaştırma açısından %3 OS ve %1 OS dışında diğer gruplarda farklılaşma sağlandı. Sonuç: Sonuç olarak özellikle %10 OS ve %5 OS kullanılarak MKH kültürleri yapılabileceği saptandı.

Keywords

• Mesenchymal stem cell; autologous serum; bone marrow; fetal bovine serum

İnsan Kemik İliği Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerin Otolog Serum ile Kültüre Edilmesi

Öz

Amaç: Mezenkimal kök hücreler (MKH) en sık kemik iliğinden elde edilen ve bir çok dokuya farklılaşma yeteneğine sahip çok yönelimli öncü hücrelerdir. MKH'ler %10 fetal bovin serumlu (FBS) besiyerinde üretilirler. Bu çalışmada amaç FBS'un olası risklerinden uzaklaşılması için otolog serum kullanarak klinik kullanım için uygun MKH üretimini sağlamaktır. Gereç ve Yöntemler: Yaşları 28-34 arasında değişen 10 kemik iliği donoründen yazılı onamları alınarak 10 mL kemik iliği ve 500 mL periferik kan örneği alındı. Kemik iliğinden fikol yoğunluk derecelendirme yöntemiyle mononükleer hücreler izole edildi. Eşit sayıda hücre (1x106/mL) RPMI-1640 medium kullanılarak %10 FBS, otolog serum (OS), %10, %5, %3 ve %1 konsantrasyonlarında kültüre edildi. Her pasaj arasında morfolojik değerlendirme, hücre sayımı ve akım sitometrik yöntemler kullanılarak immunfenotipik analizler yapıldı. Üçüncü pasaja ulaşan gruplarda yağ dokusuna farklılaştırma gerçekleştirildi. Bulgular: Hücre sayımı ve izolasyon açısından en iyi grubun %10 OS grubu olduğu gösterildi. Buna ilave olarak %5 OS ve %10 FBS gruplarındaki sonuçların benzer olduğu gözlemlendi. Akım sitometrik sonuçlar değerlendirildiğinde gruplar arasında istatistiksel fark yoktu. Yağ dokusuna farklılaştırma açısından %3 OS ve %1 OS dışında diğer gruplarda farklılaşma sağlandı. Sonuç: Sonuç olarak özellikle %10 OS ve %5 OS kullanılarak MKH kültürleri yapılabileceği saptandı.

Anahtar Kelimeler

• Mezenkimal kök hücre, otolog serum, kemik iliği, fetal buzağı serum

Kaynakça

1. Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 1991;9:641-50.
2. Verfaillie CM, Pera MF, Lansdorp PM. Stem cells: Hype and reality. Hematology 2002:369-91.
3. Dazzi F, Horwood NJ. Potential of mesenchymal stem cell therapy. Curr Opin Oncol. 2007;19:650-5.
4. Friedenstein AJ, Piatetzky-Shapiro II, Petrakova KV. Petrakova, Osteogenesis in transplants of bone marrow cells, J Embryol Exp Morphol 1996;16:381-90.
5. Friedenstein AJ. Precursor cells of mechanocytes, Int Rev Cytol 1976; 47: 327-59.
6. Dazzi F, Ramasamy R, Glennie S, Jones SP, Roberts I. The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis. Blood Rev. 2006;20:161-71.
7. Valtieri M, Sorrentino A. The mesenchymal stromal cell contribution to homeostasis. J Cell Physiol. 2008;217:296-300.
8. Arthur A, Zannettino A, Gronthos S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. J Cell Physiol. 2008:15;218:237-45.

9. Lazarus HM, Haynesworth SE, Gerson SL, Rosenthal NS, Caplan AI. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use, Bone Marrow Transplant 1995;16:557-64.
10. Deans RJ, Moseley AB. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Exp Hematol. 2000;28:875-84.
11. Horwitz EM, Gordon PL, Koo WK, Marx JC, Neel MD, McNall RY, et al., Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: implications for cell therapy of bone, Proc Natl Acad Sci U S A 99 2002;99:8932-7.
12. K. Le Blanc, C. Tammik, K. Rosendahl, E. Zetterberg and O. Ringden, HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells, Exp Hematol 2003;31:890-6.
13. Psaltis PJ, Zannettino AC, Worthley SG, Gronthos S. Concise review: mesenchymal stromal cells: potential for cardiovascular repair.Stem Cells. 2008;26:2201-10.
14. Verfaillie CM, Schwartz R, Reyes M, Jiang Y. Unexpected potential of adult stem cells. Ann N Y Acad Sci. 2003;996:231-4.
15. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284:143-7.
16. L. Tuschong SL, Soenen RM, Blaese F, Candotti and LM. Muul, Immune response to fetal calf serum by two adenosine deaminase-deficient patients after T cell gene therapy, Hum Gene Ther 2002;13:1605-10.
17. Mackensen A, Dräger R, Schlesier M, Mertelsmann R, Lindemann A. Lindemann, Presence of IgE antibodies to bovine serum albumin in a patient developing anaphylaxis after vaccination with human peptide-pulsed dendritic cells, Cancer Immunol Immunother 2000;49:152-6.
18. Selvaggi TA, Walker RE, Fleisher TA. Fleisher, Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions, Blood 1997;89:776-9.
19. MacDermott RP, Bragdon MJ. Fetal calf serum augmentation during cell separation procedures accounts for the majority of human autologous mixed leukocyte reactivity, Behring Inst Mitt 1983;122-8.
20. Yamamoto N, Isobe M, Negishi A, Yoshimasu H, Shimokawa H, Ohya K et al. Effects of autologous serum on osteoblastic differentiation in human bone marrow cells, J Med Dent Sci 2003;50:63-9.
21. Yilmaz M, Ovali E, Akdogan E, Durmus A, Sonmez M, Dikmen T, et al. Autologous serum is more effective than fetal bovine serum on proliferation of bone marrow derived human mesenchymal stem cells. Saudi Med J. 2008;29:306-9.
22. Stute N, Holtz K, Bubenheim M, Lange C, Blake F and Zander AR. Autologous serum for isolation and expansion of human mesenchymal stem cells for clinical use. Experimental Hematology 2004;32:1212-25.
23. Vogel JP, Szalay K, Geiger F, Kramer M, Richter W, Kasten P. Platelet- rich plasma improves expansion of human mesenchymal stem cells and retains differantiation capacity and in vivo bone formation in calcium phosphate ceramics. Platelets 2006;17:462-9.
24. Klein R, Dumble RJ. Transmission of Creutzfeldt-Jakob disease by blood transfusion Lancet 1993;341:768.
25. Will RG, Ironside JW, Zeidler M, Cousens SN, Estibeiro K, Alperovitch A et al. A new variant Creutzfeldt-Jakob disease in the UK. Lancet 1996;347:921-5.
26. Haynesworth SE, Baber MA, Caplan AI. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies, Bone 1992;13:69-80.
27. Lillie RD. Various oil soluble dyes as fat stains in the supersaturated isopropanol technic. Stain Technol. 1944;19:55-8.
28. Fibbe WE, Noort WA. Mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cell transplantation. Ann N Y Acad Sci. 2003;996:235-44.
29. Shigeno Y, Ashton BA. Human bone-cell proliferation in vitro decreases with human donor age. J Bone Joint Surg BR. 1995;77:139-42.
30. Yamamoto N, Isobe M, Negishi A, Yoshimasu H, Shimokawa H, Ohya K, et al. In vitro control of human bone marrow stromal cells for bone tissue engineering. Tissue Eng. 2002;8:941-53.
31. Yamamoto N, Isobe M, Negishi A, Yoshimasu H, Shimokawa H, Ohya K, et al. Effects of autologous serum on osteoblastic differentiation in human bone marrow cells. J Med Dent Sci. 2003;50:63-9.
32. Koller MR, Maher RJ, Manchel I, Oxender M, Smith AK. Alternatives to animal sera for human bone marrow cell expansion: human serum and serum-free media. J Hematother. 1998;7:413-23.
33. Kuznetsov SA, Mnakani MH, Robey PG. Effect of serum on human bone marrow stromal cells: ex vivo expansion and in vivo bone formation. Transplantation. 2000;70:1780-7.
34. Yamaguchi M, Hirayama F, Wakamoto S, Fujihara M, Murahashi H, Sato N, et al. Bone marrow stromal cells prepared using AB serum and bFGF for hematopoietic stem cells expansion. Transfusion 2002;42:921-7.