The Production Capabilities of Laccase and Mannanase Enzymes of The Bacteries Isolated from Water and Sediment Samples Collected from The Van Lake

Abstract

The aim of this study is the characterization and diagnosis of bacteria that have the ability to produce laccase and mannanase enzymes from water and sediment samples collected from Lake Van. The material of this research were form water and sediment samples collected from Van Lake. The isolation study was carried out on the alkali medium by dilution plate method. Isolate with two different colony morphologies were observed. Colony diameter, pigmentation, cell shape, gram reaction, indole test, citrate test, voges-proskauer (vp), arabinose, mannitol, sucrose, adonitol, methyl_d-glycoside, cellobiosis, mannose, salicin, trahelosis, galactose, inositol, rafinose, inulin, sorbitol, xylose, melesitose, glucose, arginine, nitrate reduction, beta galactosidase, oxidase, laccase enzyme activity, mannanase enzyme activity, starch hydrolysis, tween 80 hydrolysis, skim milk hydrolysis and xylan hydrolysis tests have made. The ability of isolates to produce laccase enzyme was evaluated with 0.2% mM ABTS and 0.1% mM CuSO4. Their ability to produce mannanase enzyme was determined using an alkaline medium containing 1% mannose and phenol. 16S rRNA gene region of 2 isolates whose genomic DNA was isolated were amplified with universal primers of 27F and 1492R and sequence analysis was performed. Phylogenic trees were created with the distance matrix of Jukes and Cantor by selecting the Maximum Likelihood algorithm with the Mega 7.0.18 package program. It was observed that all of the isolates were negative in terms of laccase enzyme and N1 and N2 isolates were positive in terms of mannanase enzyme. In the phylogenetic tree created for N1 isolate, Halomonas bacteria was clustered with a strong homology among themselves. Bacillus bacteria were generally clustered with a strong homology in the phylogenetic tree created for N2 isolate. N1 and N2 isolates were diagnosed as N1 Halomonas stevensii and N2 Bacillus agaradhaerens according to their morphological, physiological, biochemical properties and 16S rRNA gene region analysis.

Keywords

• 16S rRNA
• laccase
• mannanase

Van Gölü’nden Toplanan Su ve Sediment Numunelerinden İzole Edilen Bakterilerin Lakkaz ve Mannanaz Enzimlerini Üretme Kabiliyetleri

Öz

Bu çalışmanın amacı, Van Gölü’nden toplanan su ve sediment numunelerinden lakkaz ve mannanaz enzimi üretme kabiliyetlerine sahip bakterilerin karakterizasyonudur. Bu araştırmanın materyalini Van Gölü’nden toplanan su ve sediment numuneleri oluşturmuştur. İzolasyon çalışması dilüsyon plak yöntemi ile alkali besiyerinde gerçekleştirilmiştir. İki farklı koloni morfolojisine sahip izolat gözlemlenmiştir. İzolatlara koloni çapı, pigmentasyon, hücre şekli, gram reaksiyonu, indol testi, sitrat testi, voges-proskauer (vp), arabinoz, mannitol, sükroz, adonitol,metil_d-glikozit, selobiyoz, mannoz, salicin, traheloz, galaktoz, inositol, rafinoz, inulin, sorbitol, ksiloz, melesitoz, glikoz, arjinin, nitrat redüksiyonu, beta galaktosidaz, oksidaz, lakkaz enzim aktivitesi, mannanaz enzim aktivitesi, nişasta hidrolizi, tween 80 hidrolizi, skim milk hidrolizi ve ksilan hidrolizi testleri uygulanmıştır. İzolatların lakkaz enzimini üretme kabiliyetlerine %0.2 mM ABTS ve %0.1 mM CuSO4 ile bakılmıştır. Mannanaz enzimi üretme kabiliyetleri %1 mannoz ve fenol içeren alkali besiyeri kullanılarak belirlenmiştir. Genomik DNA’sı izole edilen 2 izolatın 16S rRNA gen bölgesi 27F ve 1492R evrensel primerleri ile amplifiye edilip sekans analizi yapılmıştır. Mega 7.0.18 paket programı ile Maksimum Olabilirlik algoritması seçilerek Jukes ve Cantor'un uzaklık matrisi ile filogenik ağaçlar oluşturulmuştur. İzolatların tümünün lakkaz enzimi yönünden negatif olduğu, mannanaz enzimi yönünden N1 ve N2 izolatlarının pozitif olduğu görülmüştür. N1 izolatı için oluşturulan filogenetik ağaçta Halomonas bakterileri kendi aralarında güçlü bir homoloji ile kümelenmiştir. N2 izolatı için oluşturulan filogenetik ağaçta Bacillus bakterileri genel olarak güçlü bir homoloji ile kümelenmiştir. N1 ve N2 izolatları, morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal özelliklerine ve 16S rRNA gen bölgesi analizine göre N1 Halomonas stevensii ve N2 Bacillus agaradhaerens olarak teşhis edilmiştir.

Anahtar Kelimeler

• 16S rRNA
• mannanaz
• lakkaz

Kaynakça

1. Arık, B., Körlü, A. E., & Duran, K. (2008). Lakkaz Enzimlerinin Tekstilde Kullanım Alanları. Tekstil Teknolojileri Elektronik Dergisi, 2(2).
2. Awla, F., Özdemir, K., Ertaş, M. (2017). Irak-Erbil'den Alınan Bazı Toprak Numunelerinden Streptomyces Bakterilerinin İzolasyonu, Ekstraselüler Hidrolitik Enzim Kabiliyetlerinin Belirlenmesi ve 16S rDNA Analizi. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 22(2), 132-138.
3. Busse, H. J., Denner, E. B. M., and Lubitz, W. (1996). Classification and identification of bacteria: current approaches to an old problem. Overview of methods used in bacterial systematics. J. Biotechnol. 47, 3–38. doi: 10.1016/0168-1656(96)01379-X.
4. Chandra, R., Chowdhary, P. (2015). Properties of bacterial laccases and their application in bioremediation of industrial wastes. Environ Sci Process Impacts, 17(2), 326-42. doi: 10.1039/c4em00627e.
5. Chen, F., Sun, J., Han, Z., Yang, X., Xian, J., Lv, A., Hu, X., Shi,H. (2019). Isolation, Identification and Characteristics of Aeromonas veronii From Diseased Crucian Carp (Carassius auratus gibelio). Front. Microbiol. 10, 2742. doi: 10.3389/fmicb.2019.02742.
6. Demiralp, B., Büyük, İ., Aras, S., Cansaran-Duman, D. (2015). Lakkaz enziminin endüstriyel ve biyoteknoloji alanında kullanımı. Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi. Turk Hij. Den. Biyol. Derg., 72(4), 351-68.
7. Dhawan, S., Kaur, J., 2007. Microbial mannanases: an overview of production and applications. Crit. Rev. Biotechnol. 27(4): 197–216 Feng, Y., He, Z., Ong, S.L., Hu, J., Zhang, Z., Ng, W.J., 2003. Optimization of agitation, aeration, and temperature conditions for maximum beta-mannanase production. Enzyme and Microbial Technology. 32: 282–289.
8. George, M.G., Julia, A.B., Timothy, G.L., 2005. Bergey’s manual of systematic bacteriology. In Volume 2: The Proteobacteria (pp. 552-556). Springer-Verlag, Berlin.

9. Horikoshi, K. (1999). Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63, 735–750.
10. Ibrahim, A. S. S., Al-Salamah, A. A., Elbadawi, Y. B., El-Tayeb, M. A., Almaary, K. S., & Elagib, A. A. (2016). Alkaline protease from a new halotolerant alkaliphilic Bacillus agaradhaerens strain ak-r isolated from egyptian soda lakes . Bioscience Journal, 32(6). https://doi.org/10.14393/BJ-v32n1a2016-33251.
11. Jukes, T. H., Cantor, C. R. (1969) Evolution of protein molecules. In Munro HN, editor, Mammalian Protein Metabolism, pp. 21-132, Academic Press, New York.
12. Khalikova E., Somersalo S., Korpela T. (2019) Metabolites Produced by Alkaliphiles with Potential Biotechnological Applications. In: Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Springer, Berlin, Heidelberg. DOI: https://doi.org/10.1007/10_2019_96.
13. Kim, K. K., Lee, K. C., Oh, H. M., Lee, J. S. (2010). Halomonas stevensii sp. nov., Halomonas hamiltonii sp. nov. and Halomonas johnsoniae sp. nov., isolated from a renal care centre. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60(Pt 2):369–77. Epub 2009/08/05. 10.1099/ijs.0.021105-0.
14. Kumar, S., Nei, M., Dudley, J., Tamura, K. (2008). MEGA: a biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Briefings in bioinformatics, 9(4), 299–306. https://doi.org/10.1093/bib/bbn017.
15. Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahl, D. A., Sogin, M. L., & Pace, N. R. (1985). Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences, 82(20), 6955-6959.
16. Nikiforov, Y. E., & Howles, P. N. (2001). Polymerase chain reaction. In Morphology Methods (pp. 181-207). Humana Press.
17. Öğün, E., Özdemir, K., Özok, N., Ertaş, M , Öztürk, F. (2018b). Sarıkamış(KARS) Yöresinde Pinus sylvestris L. Orman Topraklarından İzole Edilen Ektraselular Lakkaz Üreten Bacillus megaterium S1 İzolatının Karakterizasyonu. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 23(1), 79-86.
18. Özdemir, K., Öğün, E., Ertaş, M., Özok, N. (2018a). Kozluk (Batman) Tuzla Gözü Tuzlasından İzole Edilen Ektraselüler İnulinaz Enzimi Üreten Salinivibrio T1 İzolatının Karakterizasyonu. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 23(1), 60-68.
19. Sharef, G., Özdemir, K., Ertaş, M. (2018). Awa Sppi Nehri’nden (Süleymaniye-Irak) İzole Edilen Acidithiobacillus Cinsi Bakterilerin Ektraselüler Hidrolitik Enzim Üretme Kabiliyetlerinin Belirlenmesi ve 16S rDNA Analizi. Commagene Journal of Biology, 2(1), 17-20. DOI: 10.31594/commagene.392847.
20. Shekher, R., Sehgal, S., Kamthania, M., & Kumar, A. (2011). Laccase: microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications. Enzyme research. Volume 2011, Article ID 217861, 11 pages doi:10.4061/2011/217861.
21. Singh, G., Bhalla, A., Kaur, P., Capalash, N., Sharma, P. (2011). Laccase from prokaryotes: a new source for an old enzyme. Reviews in Environmental Science and Bio/technology, 10(4), 309-326.
22. Van den Burg, B. (2003). Extremophiles as a source for novel enzymes. Curr. Opin. Microbiol. 6(3), 213-8. DOI: 10.1016/s1369-5274(03)00060-2.
23. Wiseman, A. (ed.) (1987). Handbook of Enzyme Biotechnology. (2nd ed.) Ellis Horwood Ltd., UK.