Clostridium septicum Aşılarında Toksin Nötralizasyon Testine Alternatif Vero Hücreleri Kullanılarak Etkinliğin Belirlenmesi

Öz

Bu çalışmada, Clostridial aşıların kontrolünde 4R prensipleri ile örtüşmeyen klasik toksin nötralizasyon testi (TNT) yerine, Vero hücre hatlarında nötralizasyon analizinin uygulanabilirliğinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada, Bornova Veteriner Kontrol Enstitüsü Veteriner Biyolojik Ürünler Kontrol Laboratuvarına rutin satış izni kapsamında gönderilen farklı üreticilere ait 20 adet Clostridium septicum alfa toksoid içeren aşı ile 10 adet bu komponentten yoksun (clostridial veya clostridial olmayan) aşı kullanılmıştır. Her bir aşı için daha önce hastalık ve aşılama öyküsü bulunmayan New Zealand White ırkı 10 adet tavşan immünize edilmiş ve elde edilen serumlar eşit olarak bölünerek Vero hücre hatlarında nötralizasyon testi ve her serum için 15 adet fare kullanılarak TNT uygulanmıştır. TNT sonuçlarına göre, septicum içeren 20 aşının 16’sı limit geçer, 4’ü ise limit altında bulunmuş; septicum içermeyen aşıların serumlarında antitoksin oluşmadığından tüm fareler ölmüştür. Vero hücre nötralizasyon analizinde de TNT ile paralel sonuçlar elde edilmiş ve yöntemin TNT’ye göre sensitivite ve spesifitesi %100 olarak hesaplanmıştır. Sonuç olarak, Vero hücre nötralizasyon analizinin TNT ile uyumlu, daha az zaman ve maliyet gerektiren, stabil ve güvenilir bir alternatif yöntem olduğu ortaya konmuştur.

Anahtar Kelimeler

• Aşı
• Septicum toxin
• Toksin nötralizasyon test
• Vero

Destekleyen Kurum

Bu çalışma Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP) tarafından finanse edilmiştir.

Proje Numarası

VTF-23004

Etik Beyan

Bu çalışma için etik onay, Bornova Veteriner Kontrol Enstitüsü Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından 19 Temmuz 2022 tarihinde (Karar No: 2022/5) alınmıştır.

Teşekkür

Bu çalışmanın bir kısmı daha önce 4-6 Eylül 2025 tarihlerinde Türkiye'nin Aksaray şehrinde düzenlenen 6. Ulusal Laboratuvar Hayvan Bilimi Kongresi'nde sözlü sunum olarak sunulmuştur (Sözlü Sunum No: 08). Bu çalışma, Bilimsel Araştırma Projeleri (Proje No: VTF-23004) tarafından desteklenmiştir ve ilgili yazarın doktora tezinin bir özetidir. Yazarlar, bu çalışmayla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Yazarlar, teknik yardım ve el yazması düzenleme desteği sağlayan Dr. Ahmet ARSLAN'a teşekkür ederler.

Determinatin of Potency in Clostridium septicum Vaccines by In Vitro Toxin Neutralization Test Using Vero Cells

Öz

This study aimed to evaluate the applicability of a Vero cell–based neutralization assay as an alternative to the toxin neutralization test (TNT), which does not comply with the 4R principles, for the control of clostridial vaccines. In the study, 20 vaccines containing Clostridium septicum alpha toxoid and 10 vaccines lacking this component (clostridial or non-clostridial), submitted to the Bornova Veterinary Control Institute, Veterinary Biological Products Control Laboratory for routine marketing authorization, were used. For each vaccine, ten New Zealand White rabbits with no history of disease or vaccination were immunized, and sera were collected. The sera were equally divided and subjected to neutralization analysis in Vero cell lines and to TNT using 15 mice per serum sample. According to TNT results, 16 of the 20 C. septicum–containing vaccines were found to be above the acceptance limit, while 4 were below the limit. In sera obtained from rabbits vaccinated with vaccines lacking C. septicum, no antitoxin formation was detected and all mice died in TNT. The Vero cell–based assay yielded results parallel to TNT, with the sensitivity and specificity of the new method calculated as 100%. In conclusion, the Vero cell neutralization assay provided results comparable to TNT while requiring less time and cost, and offering more stable and reliable outcomes.

Anahtar Kelimeler

• Potency
• Septicum toxin
• Toxin neutralization test
• Vaccine

Destekleyen Kurum

This study was funded by the Aydın Adnan Menderes University Scientific Research Projects (BAP).

Proje Numarası

VTF-23004

Etik Beyan

Ethical approval for this study was obtained from the Animal Experiments Ethics Committee of the Bornova Veterinary Control Institute on 19 July 2022 (Decision No: 2022/5).

Teşekkür

Part of this study was previously presented as an oral presentation at the 6th National Laboratory Animal Science Congress, held in Aksaray, Türkiye, on 4–6 September 2025 (Oral Presentation No: 08). This study was supported by the Scientific Research Projects (Project No: VTF-23004) and is a summary from the doctoral thesis of the corresponding author. The authors declare that there are no conflicts of interest related to this study. The authors would like to thank Dr. Ahmet ARSLAN for providing technical assistance and support in manuscript editing.

Kaynakça

1. Alves, M. L. F., Ferreira, M. R. A., Donassolo, R. A., Rodrigues, R. R., Conceição, F. R. (2021). Clostridium septicum: A review in the light of alpha-toxin and development of vaccines. Vaccine, 39(35), 4949–4956. doi:10.1016/j.vaccine.2021.07.019
2. Arslan, A., Erbaş, G. (2023). Determining the Potency of Vaccines Containing Clostridium perfringens Epsilon Toxoid via Toxicity Analysis in MDCK Cell Lines. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi, 34(1), 59–66. https://doi.org/10.35864/evmd.1192288
3. Borrmann, E., Schulze, F. (1999). Detection of Clostridium novyi type B α toxin by cell culture systems . FEMS Immunology and Medical Microbiology, 24(3), 275–280. https://doi.org/10.1111/j.1574-695x.1999.tb01294.x
4. Borrmann, E., Schulze, F., Cussler, K., Hänel, I., Diller, R. (2006). Development of a cell culture assay for the quantitative determination of vaccination-induced antibodies in rabbit sera against Clostridium perfringens epsilon toxin and Clostridium novyi alpha toxin. Veterinary Microbiology, 114(1–2), 41–50. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2005.10.043
5. Ebert, E., Oppling, V., Werner, E., Cussler, K. (1999). Development and prevalidation of two differentsystems fort he potency testing of Clostridium perfringens β and Ꜫ- toxoid containing veterinary vaccines, FEMS Immunology & Medical Microbiology. 24, 299-311. doi: 10.1111/j.1574-695X.1999.tb01298.x.
6. European Pharmacopoeia (EP). (2022). Clostridium septicum vaccine for veterinary use (Monograpf 0364), Version 10.8, 6834-6836.
7. Feoktistova, M., Geserick, P., & Leverkus, M. (2016). Crystal violet assay for determining viability of cultured cells. Cold Spring Harbor Protocols, 2016(4), 343–346. https://doi.org/10.1101/pdb.prot087379
8. Gazioglu, A., Karagülle, B., Yüksel, H., Nuri Açlk, M., Keçeci, H., Dörtbudak, M. B., Çetinkaya, B. (2018). Sudden death due to gas gangrene caused by Clostridium septicum in goats. BMC Veterinary Research, 14(1), 1–6. https://doi.org/10.1186/s12917-018-1747-y

9. Hartung, T. (2010). Comparative analysis of the revised directive 2010/63/EU for the protection of laboratory animals with its predecessor 86/609/EEC - A t4 report. Altex, 27(4), 285–303. https://doi.org/10.14573/altex.2010.4.285
10. Huang, J., Zhao, B., Liu, T., Kang, L., Li, J., Guo, Z., Chen, M., Gao, S., Wang, J., Li, Y., Wang, J., Xin, W. (2023). Statins as Potential Preventative Treatment of ETX and Multiple Pore-Forming Toxin-Induced Diseases. International Journal of Molecular Sciences, 24(6). https://doi.org/10.3390/ijms24065414
11. Ishiyama, M., Tominaga, H., Shiga, M., Sasamoto, K., Okhura Y., Ueno, K., (1996). A Combined Assay of Cell Viability and in Vitro Cytotoxicity with a Highly Water- Soluble Tetrazolium Salt, Neutral Red and Crystal Violet. Biological and Pharmaceutical Bulletin 19(11) 1518-1520 Vol. 19, No. 11 doi: 10.1248/bpb.19.1518
12. Jeong, C. G., Seo, B. J., Nazki, S., Jung, B. K., Khatun, A., Yang, M. S., Kim, S. C., Noh, S. H., Shin, J. H., Kim, B., and Kim, W. Il. (2020). Characterization of Clostridium novyi isolated from a sow in a sudden death case in Korea. BMC Veterinary Research, 16(1), 1–9. https://doi.org/10.1186/s12917-020-02349-9
13. Kang, M., Long, T., Chang, C., Meng, T., Ma, H., Li, Z., Li, P., Chen, Y. (2022). A Review of the Ethical Use of Animals in Functional Experimental Research in China Based on the “four R” Principles of Reduction, Replacement, Refinement, and Responsibility. Medical Science Monitor, 28, 1–6. https://doi.org/10.12659/MSM.938807
14. Kaushik, H., Deshmukh, S. K., Solanki, A. K., Bhatia, B., Tiwari, A., Garg, L. C. (2019). Immunization with recombinant fusion of LTB and linear epitope (40–62) of epsilon toxin elicits protective immune response against the epsilon toxin of Clostridium perfringens type D. AMB Express, 9(1). https://doi.org/10.1186/s13568-019-0824-3 Kocaçalışkan İ., Akanıl Bingöl, N. (2021). Biyoistatistik. N. Argun (Ed.) Korelasyon ve Regresyon Testi (4. bs., ss. 14- 21)
15. Lima, C. G. R., Lobato, Z. I. P., Pires, P., Silva, R. O., Salvarani, F. M., Assis, R. A., and Lobato, F. C. F. (2011). Padronização de teste de Potência in vitro Para vacinas que contenham toxoide alfa de Clostridium novyi tipo B. Arquivos Do Instituto Biológico, 78(4), 507–512. https://doi.org/10.1590/1808-1657v78p5072011
16. Redhead, K., Wood, K., Jackson, K. (2012). Testing of veterinary clostridial vaccines: From Mouse to microtitre plate, In: Potency testing of veterinary vaccines for animals: The way from in vivo to in vitro, Jungback C. (Ed.), Vol 134, KArger AG, Basel, Switzerland, 45-50
17. Romberg, J., Lang, S., Balks, E., Kamphuis, E., Duchow, K., Loos, D., Rau, H., Motitschke, A., Jungbäck, C. (2012). Potency testing of veterinary vaccines: The way from invivo to invitro. Biologicals, 40(1), 100–106. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2011.10.004
18. Salvarani, F. M., Lobato, Z. I. P., Assis, R. A., Lima, C. G. R. D., Silva, R. O. S., Pires, P. S., Lobato, F. C. F. (2010). In vitro evaluation of Clostridium septicum alpha toxoid. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, 62(4), 778–783. https://doi.org/10.1590/s0102-093520100004000022
19. Salvarini, F. M., Lobato, Z. I. P., Pires, P. S., Silva, R. O. S., Alves, G. G., Pereira, P. L. L., and Lobato, F. C. F. (2013). In vitro potency test for evaluation of Clostridium perfringens type D epsilon toxoid. Arquivos Do Instituto Biológico, 80(4), 450–452. https://doi.org/10.1590/s1808-16572013000400013
20. Sinitskaya, N., Behr-Gross, M.-E. Validation of alternative/3Rs methods for the in-process quality control of Clostridium septicum vaccines (BSP130 participants workshop report) Blood transfusion at Council of Europe View project Bıologıcal Standardısatıon Programme View project. 2015, Egmond aan Zee, Netherlands
21. Souza Júnior, M. F., Lobato, Z. I. P., Pires, P. S., Silva, R. O. S., Salvarani, F. M., Assis, R. A. de, Lobato, F. C. F. (2010). Padronização da titulação da toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D em linhagem contínua de células como alternativa ao bioensaio animal. Ciência Rural, 40(3), 600–603. https://doi.org/10.1590/s0103-84782010005000024
22. Sümbüloğlu, K., Sümbüloğlu, V. (2021). Biyoistatistik. M.Tahir Hatipoğlu (Ed.) Korelasyon ve Regresyon Analizi: Korelasyon Analizi içinde Ankara: Hatipoğlu Yayıncılık, (20. bs.,ss. 186-196).
23. USDA-CVB. (2011). Potency testing Clostridium septicum antigen, BBPRO1301.03, Center for Veterinary Biologics, USDA Animal and Plant Health Inspection Services, Ames, 1-10 https://www.aphis.usda.gov/animal_health/vet_biologics/publications/BBPRO1301.pdf
24. USDA-CVB. (2022). Potency Test for Clostridium septicum Alpha Antitoxin Using a Cell Assay, BBPRO1009.04, Center for Veterinary Biologics, USDA Animal and Plant Health Inspection Services, Ames, 1-8 https://www.aphis.usda.gov/animal_health/vet_biologics/publications/cvb-pro-0009.pdf
25. Zaragoza, N. E., Orellana, C. A., Moonen, G. A., Moutafis, G., and Marcellin, E. (2019). Vaccine production to protect animals against pathogenic clostridia. Toxins, 11(9), 1–29. https://doi.org/10.3390/toxins11090525 WEB 1. (2023). : Deneysel Ve Diğer Bilimsel Amaçlarla Kullanılan Hayvanların Refah Ve Korunmasına Dair Kılavuz https://www.tarimorman.gov.tr/Belgeler/Mevzuat/Talimatlar/gkgm/deneysel_hayvan_koruma_kilavuz.pdff (08.06.2023)