Yaygın Salmonella Serovarlarının Moleküler Tekniklerle Tiplendirilmesi

Yıl 2017, , 85 - 95, 15.12.2017

Elçin Günaydın Selahattin Şen K. Serdar Diker Derya Karataş Yeni Özlem Kardoğan H. Kaan Müştak Özlem Şahan

https://doi.org/10.35864/evmd.523428

Öz

Bu çalışmanın amacı, Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü (VKMAE), Bakteriyolojik Teşhis Laboratuvarı sorumluluğunda 2009-2011 yılları arasında Salmonella Prevalans çalışması kapsamında, Kauffmann-White serotiplendirme şeması ile tiplendirmesi yapılan toplam 907 Salmonella izolatının, serogrup Salmonella multiplex- PZR, Faz 1 Salmonella multiplex-PZR ve Faz 2 Salmonella multiplex-PZR kullanarak sahada yaygın olarak sirküle olan Salmonellla serovarları için dizayn edilen primerler ile maksimum 2-3 gün gibi kısa sürede, düşük maliyetle tiplendirmesini yapabilmektir. Bu çalışmayla, konvansiyonel yöntemle faz 1 ve faz 2 antijenlerinin eş zamanlı sergilenmemesi sonucunda ekstra laboratuvar iş yükü, olası çarpraz reaksiyonlar sebepli ekstra antiserum harcanması dolayısıyla yaşanılan zaman kaybı ve yüksek maliyetin üstesinden gelineceği öngörüldü. Ayrıca, 2 testin (multiplex-PZR ve konvansiyel serotiplendirme) örtüşmediği durumlar bakterilerin 6.5 kb operonunu inceleyen ribotiplendirme desteğiyle çözülmesi yoluna gidilmiştir. Çalışmada kullanılacak primerler ile 907 izolatın % 29.32’sinin (266 izolat; 15 farklı serovar) üç antijenik yapısı da tam olarak identifiye edilip, isimlendirilebilmiştir. İncelenen izolatların somatik, flagellar 1 ve flagellar 2 antijenlerinin sırasıyla; %54.56 (490), %90.95 (825) ve %78.94 (716)’ü tespit edilebilmiştir. İzolatların en azından % 50’sinin tam olarak isimlendirilebileceği öngörülmüştür ancak Salmonella Infantis (S. Infantis) ve S. Mbandaka suşarında somatik antijeni amplifiye eden primer olmasına rağmen somatik antijen tespit edilememiştir. Bu suşlar ribotiplendirmeye alınmıştır. Konvansiyonel seroloji, multiplex-PZR ve ribotiplendirme değerlendirildiğinde; ribotiplendirme ve multiplex-PZR’ların gold standart metoda destek metodlar olarak kullanabileceği tespit edilmiştir. Özet olarak; çalışmada mevcut olan primerler sadece sahada yaygın olan serovarların somatik, faz 1 ve faz 2 antijenlerine spesifik oldukları için PZR tüm serovarları identifiye etmekte yetersiz kalmıştır. Sonuç olarak ucuz, hızlı ve duyarlı metot olan multiplex-PZR’ların belirli somatik, flagellar 1 ve 2 antijenlerinin tespitinde konvansiyonel serolojik yönteme destek olarak kullanılabileceği kanısına varılmıştır.

Anahtar Kelimeler

Salmonella serovarları, Multiplex-PZR

Kaynakça

• 1. Aarts HJ, LA Van Lith, J. Keijer, (1998). High resolution genotyping of Salmonella strains by AFLP-fingerprinting. Lett Appl Microbiol, 26, 131-135. 2. Bastin DA, Reeves PR, (1995). Sequence and Analysis of the O antigen gene (rfb) cluster of Escherichia coli O111. Gene, 16, 17-23. 3. Bayindir Bilman F, Gunaydin E, Turhanoglu M, Akkoc A, (2014). The Value of PCR Method in the Species-Level Identification of a Mucoid Salmonella sp. Strain Isolated from the Urine Culture of a Case with Asymptomatic Nephrolithiasis. Mikrobiol Bul, 48(1), 151-159. 4. Echeita MA and Usera MA, (1998). Rapid Identification of Salmonella spp. phase 2 antigens of the H1 antigenic complex using ‘multiplex PCR’. Res Microbiol, 149, 757-761. 5. Echeita MA, Herrera S, Garazier J and Usera MA, (2002). Multiplex PCR- based detection and identification of the most common Salmonella-second-phase flagellar antigens. Research in Microbiol, 153, 107-113. 6. Fitzgerald C, Sherwood R, Gheesling LL, Brenner FW, Fields PI, (2003). Molecular analysis of the rfb O antigen gene cluster of Salmonella enterica serogroup O:6,14 and development of a serogroup-specific PCR assay. Appl Environ Microbiol, 69(10), 6099-105. 7. Grazier J, Lopez-Molina N, Laconcha I, Bagessen DL, Rementeria A, Vivanco A, Audicana I, Perales A, (2000). Suitable of PCR fingerprinting, Infrequent-Restriction-Site PCR, and Pulsed-Field Gel Electrophoresis, combined with computerized gel analysis, in library typing of Salmonella enterica serovar Enteritidis. Appl Environ Microbiol, 66, 5273-5281. 8. Guibourdenche M, Roggentin, P Mikoleit M, Fields PI, Bockemühl J, Grimont PA.D, Weill François-Xavier, (2010). Supplement 2003-2007 (No. 47) to the White- Kauffmann-Le Minor scheme. Res Microbiol, 161(1), 26-9. 9. Herrera-Leon S, McQuiston JR, Usera MA, Fields PI, Garazier J and Echeita MA, (2004). Multiplex PCR for Distinguishing the Most Common Phase-1 Flagellar Antigens of Salmonella spp. J Clin Microbiol, 42(6), 2581- 2586. 10. Herrera-Leon S, Ramiro R, Arroyo M, Diez R, Usera MA, Echeita MA, (2007). Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology, 158, 122-127. 11. Hong Y, Liu T, Lee MD, Hofacre CL, Maier M, White DG, Ayers S, Wang L, Berghaus R, Maurer JJ, (2008). Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologicallycorrelative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles, BMC Microbiol, 8, 178. 12. Lindstedt BA, Heir E, Vardund T, Kapperud G, (2000). Fluorescent amplified-fragment length polymorphism genotyping of Salmonella enterica subsp. enterica serovars and comparison with pulsed-field gel electrophoresis typing. J Clin Microbiol, 38, 1623-1627. 13. Lino T, (1997). Genetics of structure and function of bacterial flagella. Anu Rev Genet, 11, 161-182. 14. Luk JM, Kongmuang U, Reeves PR, Lindberg AA, (1993). Selective amplification of abequose and paratose synthase genes (rfb) by polymerase chain reaction for identification of Salmonella major serogroups (A, B, C2, and D). J Clin Microbiol, 31, 2118-2123. 15. Marolda CL, Vicarioli J, Valvano MA, (2004). Wzx proteins involved in biosynthesis of O antigen function inassociation with the first sugar of O specific lipopolisaccharide subunit. Microbiology, 150, 4095-4105. 16. Newton S, MRD Wasley, A Wilson, LT Rosenberg, JF Miller, and BA Stocker, (1991). Segment IV of a Salmonella flagellin gene specifies flagellar antigen epitopes. Mol Microbiol, 5, 419-425. 17. Patrick AD Grimont & François-Xavier Weill, (2007). Kauffmann-White Scheme Antigenic formulae of the Salmonella serovars, 9th edition, Institut Pasteur, 28 rue du Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, France. 18. Ranjbar R, Mortazavi SM, Mehrabi Tavana A, Sarshar M, Najafi A, Soruri Zanjani R, (2017), Simultaneous Molecular Detec-tion of Salmonella enterica Serovars Typhi, Enteritidis, Infantis, and Typhimurium. Iran J Public Health, 46(1),103-111. 19. Reeves MW, Evins GM, Heiba AA, Plikaytis BD, Farmer JJ, (1989). Clonal nature of Salmonella typhi and its genetic relatedness to other salmonellae as shown by multilocus enzyme electrophoresis, and proposal of S. bongori comb. J Clin Microbiol, 35, 2786-2790. 20. Samuel G, Reeves PR, (2003). Biosynthesis of O-antigens: genes and pathways involved in nucleotide sugar precursor synthesis and O-antigen assembly, Carbohydr Res, 338, 2503-2519. 21. Shah DH, Park JH, Cho MR, Kim MC, Chae JS, (2005). Allele-specific PCR method based on rfbS sequence for distinquishing Salmonella gallinarum from Salmonella pullorum: serotype-specific rfbS sequence polymorphism. J Clin Microbiol, Methods, 60, 169-177. 22. Şahan Ö, Müştak K, Torun E, Akan M, Diker S. Salmonella Infantis tanısında ribtiplendirme ve serotiplendirme yöntemlerinin karşılaştırması. 10. Uluslararası Veteriner Hekimleri Mikrobiyoloji Kongresi, 24-27 Eylül 2012, Kuşadası, AYDIN 23. Wei LN, and TM Joys, (1995). Covalent structure of three phase-1 flagellae filament proteins of Salmonella spp. J Mol Biol, 186, 791-803. 24. Zappelini L, Martone-Rocha S, Dropa M, Matté MH, Tiba MR, Breternitz BS, Razzolini MT, (2017). Effective characterization of Salmonella Enteritidis by most probable number (MPN) followed by multiplex polymerase chain reaction (PCR) methods, Environ Sci Pollut Res Int, 24(5), 4828-4834. 25. Zieg J, Silverman M, Hilmen M and Simon M, (1977). Recombinational switch for gene expression. Science, 196, 170-172.