Effects of Extender Osmolarity, Cooling Rate, Dilution Rate and Glycerol Addition Time on Post-thaw Ram Semen Characteristics and Fertilization

Yıl 2010, Cilt: 36 Sayı: 2, 33 - 46, 22.12.2010

Kemal Ak Ümüt Cirit Zekeriya Nur Süleyman Bacınoğlu Serhat Pabuççuoğlu Özen Özdaş Sema Birler

Öz

ABSTRACT

Tree experiments were designed to optimize ram semen cryopreservation and to examine the effect of the extender B osmolarity, extension time with extender A and B, presence of glycerol in freezing media, cooling rate from 30ËšC to 5°C, and dilution rate on post-thaw ram semen characteristics and fertilization.  Ram ejaculates of thick consistency with rapid wave motion (>+++) and >70% initial motility were pooled. Pooled semen was diluted with Tris based extender using a two-step dilution method. Semen motility and morphology related parameters were assessed at the following five steps : (1) Fresh, (2) after dilution with extender A, (3) at 5°C, (4) after equilibration, and (5) after thawing at 37°C for 30 min. The extender osmolarity affected significantly post-thaw semen motility, defected acrosomes (DA) and total morphological defect (TMD), generally.

There was a significant interaction between the osmolarity, cooling rates, glycerol addition time and first dilution time, on post-thaw motility, DA and TMD. Higher fertilization rates were obtained in fresh semen and Group 15 compared to Group 21 (P<0.05). In conclusion, cooling rate, extender osmolarity, presence of glycerol, dilution time with extender A and B, and dilution rates interact on post-thaw semen parameters. Glycerol included freezing media improves post-thaw semen recovery. Also, increasing the extender osmolarity resulted better post-thaw semen motility especially in the group frozen without glycerol. Post-thaw semen parameters not affected by cooling and glycerol addition time regimes, generally. Obtained data showed that presence of glycerol in freezing media have a negative effect on embryonic development and it was observed that frozen ram semen at high osmolarity without glycerol could be used for in vitro fertilization.

Key Words: Ram semen, osmolarity, cooling rate, extender

 

ÖZET

 

KOÇLARDA SULANDIRICI OZMOLARITESI, SOĞUTMA ORANI, SULANDIRMA ORANI VE GLISEROL EKLEME ZAMANININ ERITME SONRASI SPERMATOLOJIK ÖZELLiKLER VE FERTiLiZASYON ÜZERiNE ETKiLERi

Koç spermasının dondurulmasını optimize etmek ve sulandırıcı B ozmolaritesi, sulandırıcı A ve B ile sulandırma zamanı, dondurma medyumunda gliserolün varlığı veya yokluğu, +30°C'den +5°C'ye soğutma oranı ve sulandırma oranının eritme sonrası spermatolojik özellikler ve fertilite üzerine olan etkilerini belirlemek amacıyla üç deney planlandı. İyi bir kitle hareketine(>+++) ve >%70 başlangıç motilitesine sahip olan koç ejekülatları çalışmaya dahil edilerek pooling yapıldı. Sperma motilitesi ve morfolojisi ile ilgili parametreler (1) taze, (2) sulandırıcı A ile sulandırdıktan sonra, (3) 5°C'ye soğutulduktan sonra, (4) ekilibrasyon sonrası ve (5) eritme sonrasında incelendi. Sulandırıcı ozmolaritesi eritme sonrası motiliteyi, kusurlu akrozom oranını ve toplam morfolojik bozukluk oranını önemli derecede etkiledi.

Ozmolarite,soğutma oranı, gliserol ekleme zamanı ve ilk sulandırma zamanı ile eritme sonrası motilite, kusurlu akrozom oranı ve toplam morfolojik bozukluk oranları arasında önemli bir ilişki bulundu. Grup 21 ile karşılaştırıldığında taze sperma ve grup 15'te önemli derecede daha yüksek fertilizasyon oranı elde edildi.

Sonuç olarak, soğutma oranı, sulandırıcı ozmolaritesi, gliserol varlığı, sulandırıcı A ve B ile sulandırma zamanı ve sulandırma oranları ile eritme sonrası spermatolojik özellikler arasında önemli bir etkileşim bulundu. Bunun yanında sulandırıcı ozmolaritesinin artırılması, özellikle gliserol katılmayan gruplarda daha iyi eritme sonrası motilite eldesi ile sonuçlandı. Eritme sonrası spermatolojik özellikler soğutma zamanı ve gliserol ilave zamanından etkilenmedi. Elde edilen sonuçlar, dondurma medyumunda gliserol varlığının embriyonik gelişim üzerinde olumsuzbir etkisinin olduğunu ve gliserol ilave edilmeksizin yüksek ozmolariteli sulandırıcılar ile dondurulmuş koç spermasının in vitro fertilizasyonda kullanılabileceğini gösterdi.

Anahtar Kelimeler: Koç sperması, ozmolarite, soğutma oranı, sulandırıcı

Anahtar Kelimeler

Koç sperması, ozmolarite, soğutma oranı, sulandırıcı

Kaynakça

• Abdelhakeam, A.A., Graham, E . F . , Vazquez, I.A, 1991. Studies on the absence of glycerol in unfrozen and frozen ram semen: Fertility trials and the effect of dilution methods on freezing ram semen in the absence of glycerol. Cryobiology, 28: 36-42.
• Ali, S., Ahmed, N., Samad, H.A., Ahmad, K . M . , Naz, A.N., Nawaz, M., Akhtar, N., 1992. Effects of various glycerolization temperatures and equilibration periods on freezability of ram spermatozoa. Pakistan Vet J, 12: 142-144.
• Bacinoglu, S., Cirit, Ü., Nur, Z., Ak, K . , 2007. Eritilmiş koç spermasında farklı gliserol katma tekniklerinin ve soğutma hızının spermatolojik özelliklere etkisi. İst.Ü.Vet.Fak.Derg, 33: 11ı 21.
• Birler, S., Pabuççuoğlu, S., Aklan, S., Özdaş, Ö.B., Atalla, H., İleri, İ.K., 2002. İn vitro fertilizasyonla elde edilen koyun embriyolarının blastosist dönemine kadar geliştirilmesi, Turk J Vet Anim Sci, 26: 891-894.
• Coyan K., Aksoy M., Tekeli T., Ayar A., Ataman M.B., 1992. Die intrauterine Besamung von Schafen unter Anwendung des tiefgefrorenen Spermas mit Hilfe der Laparoskopie. Hayvancilik Arastırma Dergisi, 2: 15-17.
• De Leeuw, F. E . , De Leeuw, A. M., Den Daas, J . H. G., Colenbrander, B., Verkleij, A. J . , 1993. Effects of various cryoprotective agents and membrane-stabilizing compounds on bull sperm membrane integrity after cooling. Cryobiology, 30: 32-44.
• Dhami, AJ., Sahni, K . L . , Mohan, G., 1992. Effect of various cooling rates (from 30°C to 5°C) and thawing temperatures on the deep-freezing of Bos Taurus and Bos Bubalis semen, Theriogenology, 38: 565-574.
• Fabbrocini, A., Del Sorbo, C., Fasano, G., Sansone. G., 2000. Effect of differential addition of glycerol and pyruvate to extender on cryopreservation of Mediterranean buffalo (B. bubalis) spermatozoa. Theriogenology, 54: 193 -207.
• Fiser, P., Fairfull, R.W., 1984. The effect of glycerol concentration and cooling velocity on cryosurvival of ram spermatozoa frozen in straws. Cryobiology, 21: 542-551.
• Fiser, P.S., Ainsworth L . , Fairfull, R.W., 1987. Evaluation of a new diluent and different processing procedures for cryopreservarion of ram semen. Theriogenology, 28: 599-607.
• Gunay, U., Dogan, I., Nur, Z., Manolov, I., Sagırkaya, H., Soylu, M.K., Kaptan, C., Akpınar, L . , 2006. Influence of bull seminal plasma on post-thaw ram semen parameters and fertility. Bull. Vet. Inst. Pulawy, 50: 5003-5007.
• Hammadeh, M.E., Askari, A., Gerorg, T., Rosenbaum, P., Schmidt, W., 1999. Effect of freeze-thawing procedure on chromatin stability, morphological alteration and membrane integrity of human spermatozoa in fertile and subfertile men. Int J Androl, 22:155ı 62.
• Hancock, J . L . , 1952. The morphology of bull spermatozoa. J Exp Biol, 29: 445-453.
• Henry, M.A., Noiles, E . E . , Gao, D., Mazur, P., Critser, J.K., 1993. Cryopreservation of human spermatozoa. IV. The effects of cooling rate and warming rate on the maintenance of motility, plasma membrane integrity, and mitochondrial function. Fertil Steril, 60: 911-8.
• İleri, İ.K., Ak, K., Pabuççuoğlu, S., Birler, S., 2000. Reprodüksiyon ve Sun'i Tohumlama. İstanbul Üniv. Vet. Fak. Yayını. Ders Notu No: 23..
• Kakadiya, P.T., Kavani, F.S., 1995. Comparative efficiency of different dilutors for preservation of Patanwadi ram semen at refrigeration temperature. Indian J Anim Reprod, 16: 53-56.
• Liu, Z.S., Foote, R.H., Brockett, C.C., 1998. Survival of bull sperm frozen at different rates in media varying in osmolarity. Cryobiology, 37: 219ı 230.
• Maxwell, W.M.C., Landers, A.J., Evans, G., 1995. Survival and fertility of ram spermatozoa frozen in pellets, straws and minitubes. Theriogenology, 43: 1201-1210.
• Nur, Z., Zik, B., Ustuner, B., Sagirkaya, H., Ozguden, C.G., 2010. Effects of different cryoprotective agents on ram sperm morphology and DNA integrity. Theriogenology, 73: 1267-1275.
• Pérez-Pé, R., Grasa, P., Fernandez-Juan, M., Peleato, M.L., Cebriân-Pérez, J.A., Muino- Blanco, T., 2002. Seminal plasma proteins reduce protein tyrosine phosphorylation in the plasma membrane of cold-shocked ram spermatozoa. Mol Reprod Dev, 61: 226-33.
• Salamon, S., Maxwell, W.M.C., 1993. Frozen storage of ram semen. II. Causes of low fertility after cervical insemination and methods of improvement. Anim Reprod Sci, 38: 1 -36.
• Sanches-Partida, L . G . , Maxwell, W.M.C., Pateg, L . G . , Setchell, B.P., 1992. Proline and glycine betaine in the cryoprotective diluents for ram spermatozoa. Reprod Fertil Dev, 4: 113-118.
• Sayre, B.L., Lewis, G.S., 1997. Fertility and ovum fertilisation rate after laparoscopic or transcervical intrauterine artificial insemination of oxytocin-treated ewes. Theriogenology, 48: 267-275.
• Schiller, J . , Arnhold, J . , Glander, H.J., Arnold, K., 2000. Lipid analysis of human spermatozoa and seminal plasma by MALDI-TOF mass spectrometry and NMR spectroscopy-effects of freezing and thawing. Chem Phys Lipids, 106: 145-56.
• Soylu, M.K., Nur, Z. Ustuner, B., Doğan, I.,Sagırkaya, H., Gunay, U., Ak, K., 2007. Effects of various cryoprotective agents and extender osmolarity on post-thaw ram semen. Bull Vet Inst Pulawy, 51: 241 -246.
• Varisli, O., Uguz, C., Agca, C., Agca, Y . , 2008. Motility and acrosomal integrity comparisons between electro-ejaculated and epididymal ram sperm after exposure to a range of an isosmotic solutions, cryoprotective agents and low temperatures. Anim Reprod Sci, 110: 256-68.
• Woelders, H., Matthijs, A., Engel, B., 1997. Effects of trehalose and sucrose, osmolarity of the freezing medium, and cooling rate on viability and intactness of bull sperm after freezing and thawing, Cryobiology, 35: 93-105.
• Yildiz, C., Kaya, A., Aksoy, M., Tekeli, T., 2000. Influence of sugar supplementation of the extender on motility, viability and acrosomal integrity of dog spermatozoa during freezing. Theriogenology 54: 579-585.