Purification and immobilization by certain clays of Poliphenol Oxidase (PFO) from Dill (Anethum graveolens)

Öz

In this study, certain properties of Poliphenol oxidase enzyme (PFO) was investigated after the

enzyme was purified from dill and immobilized by certain clays. Optimum pH, temperature and ionic strength

for four different substrates were determined. KM ve Vmax values for the substrates at optimum conditions were

established. Immobilization was achieved by vortex after adding 0.5 mL enzyme to different amounts of clay and 1

mL buffer. PFO activity was measured spectrophotometrically at 420 nm using chatecol as the substrate. From the

measurements the IC50 ve Ki values for the activity was calculated.

The percentage inhibition of the enzyme isolated from dill was calculated from various concentrations. The

concentrations for three different clay samples were as follow: 0.066 g mL-1; 0.040 g mL-1; 0.020 g mL-1; 0.0133 g

mL-1; 0.0066 g mL-1 ve 0.0033 g mL-1. Activity for the immobilized enzyme for the selected concentrations of the

three various clays are as follow: green clay; 92%, 86%, 80%, 75%, 70% , 68% yellow clay; 80%, 79%, 76%, 75%,

70%, 69% ve red clay; 84%, 81%, 77%, 72%, 66%, 65%. These results suggest that PFO from dill are stronger

immobilized by green clay compared to PFO immobilized by red and yellow clay.

Anahtar Kelimeler

• poliphenol oxidase,chatecol,immobilization,purification,Dill,purification

Dereotundan (Anethum graveolens) Saflaştırılan Polifenol Oksidaz (PFO) Enziminin Bazı Killerle İmmobilizasyonu

Öz

Bu çalışmada dereotundan (Anethum graveolens) Polifenol oksidaz enzimi (PFO) kısmi saflaştırılarak

bazı killere immobilize edilerek bazı özellikleri incelenmiştir. Bu amaçla önce dört farklı substrat için, optimum

pH, optimum sıcaklık, optimum iyonik şiddet belirlendi. Daha sonra belirlenen optimum şartlarda bu substratlar

için KM ve Vmax değerleri tespit edildi. İmmobilizasyon işlemi için farklı miktarlarda killer alınıp, 1 ml tampon

çözelti içerisine 0.5 ml enzim ilave edilerek bir karışım oluşturulmuş daha sonra vortexlenerek immobilizasyon

işlemi gerçekleştirilmiştir. PFO enzim aktivitesi, katekol substratı varlığında 420 nm de spektrofotometrik yöntem

kullanılarak ölçülmüştür. Bu aktivitelerden yararlanarak IC50 değerleri ve Ki sabitleri hesaplanmıştır.

Konsantrasyona bağlı olarak kil içindeki enzimin inhibisyon yüzdeleri hesaplanmıştır. Buna göre; 0.066 g mL-1;

0.040 g mL-1; 0.020 g mL-1; 0.0133 g mL-1; 0.0066 g mL-1 ve 0.0033 g mL-1 konsantrasyonlarında üç farklı kilden

numuneler hazırlanmıştır. İmmobilize edilen enzim aktiviteleri, serbest enzim aktivitelerine göre yukarıdaki kil

konsantrasyonlarında yeşil kil ile sırasıyla; %92, %86, %80, %75, %70 ve %68, sarı kil ile sırasıyla ; %80, %79,

%76, %75, %70 ve %69 kırmızı kil ile sırasıyla; %84, %81, %77, %72, %66 ve %65 inhibisyona uğradıkları ve

yeşil kilin dereotu PFO enzimini diğer kırmızı ve sarı killere göre daha kuvvetle immobilize olduğu bulunmuştur.

Anahtar Kelimeler

• Dereotu,polifenol oksidaz,katekol,immobilizasyon,saflaştırma

Kaynakça

1. Al-Ismael KM, and Aburjai T, 2004. Antioxidant activity of water and alcohol extracts of chamomile flowers, anise seeds and dill seeds. jouunal science food agriculture. Volume 84 Issue 2, Pages 173-178
2. Alkan S, 1999. Katalaz enziminin sepiolit, bentonit ve kaolin killeri üzerine adsorpsiyonu ve kinetiginin incelenmesi. Doktora Tezi, Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Van
3. Arslan O, Temur A, Tozlu I, 1997. Polyphenol Oxidase from Allium sp. J Agric Food Chem;45: 2861–2863.
4. Aydemir T, 2010. Selected kinetic properties of polyphenol oxidase extracted from Rosmarinus Officinalis L. International Journal of Food Properties . 13, 475-485.
5. Coşkun G, 2007. Glutatiyon-S-Transferaz enziminin farklı taşıyıcılarda immobilizasyonu ve bazı özelliklerinin incelenmesi. Ege Üniversitesi Doktora Tezi, İzmir, 118sDemir H, Gür A, Yıldız, Gür T, 2007. Iğdır Kayısısından Polifenol Oksidaz Enziminin Kil İmmobilizasyonu ve Karakterizasyonu. 21. Ulusal Kimya Kongresi. BIY0 24 P, Malatya
6. Demirbaş Ö, 2006. Kil Mineralleri Yüzeyine Bazı Biyomakromoleküllerinin İmmobilizasyonu ve Elektrokinetik Özellikleri. Doktora Tezi, Balıkesir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Balıkesir
7. Erat M, Sakiroglu H, Kufrevioglu O. I, 2006. Purification and Characterization of Polyphenol Oxidase from Ferula sp., Food Chemistry, 95, 503-508.
8. Halim D. H and Montgomery M. W, 1978. Polyphenol oxidase of d’anjou pears (Pyruse communis, L.). J. Food Sci., 43, 603 606.

9. Heimdal, H., Bro, R., Larsen, L. M. and PFO ll, L., 1997. J. Agric. Food. Chem., 45, 2399-2406.
10. Hermann K., 1974. Uber die Phenolischen Inhaltsstoffe des Obstes. Erwerbsastbau, 16,1
11. Khan, A. A., Akhtar, S., Husain, Q., 2006. Direct immobilization of polyphenol oxidases on Celite 545 from ammonium sulphate fractioned proteins of potato (Solanum tuberrasum ), Journal of Moleculer Catalysis. 40, 58-63.
12. Lee, C.Yand Withaker, J. R., 1995. Enzymatic Browning and Its Prevention. American Chemical Society, Washington, DC.
13. Lisiewska Z, Kmiecik W, Korus A. 2006; Content of vitamin C, carotenoids, chlorophylls and polyphenols in green parts of dill (Anethum graveolens L.) depending on plant height. Journal of Food Composition and Analyssis ; 19:134–140
14. Pomerantz, S.H., 1963. Separation, purification and properties of two tyrosinases from Harmster Mclanoma. J. Biol. Chem., 238, 2351.
15. Ponting, J. D. 1960. The control of enzymatic browning of fruits, food enzymes. H.W., Schultz, ed., Avi Publ. Co., Inc, Westport, c.t.
16. Shi, C., Liu, Q., Dai, Y., Xie, Y., Xu, X., 2002. The mechanism of azide activation of polyphenol oxidase II from tobacco. Acta Biochimica Polonic, 49(4), 1029-1035.
17. Simpson, B. K., Marshall, M.R., Otwell, S. W., 1988. Polyphenol oxidases from pink and white shrimp: kinetic and other properties. J. Food Biochem., 12, 205-217.
18. Şakiroğlu, H., Öztürk, A.E., Pepe, A.E, and Erat,M., 2008. Some Kinetic Properties of Polyphenol OxidaseObtained from dill (Anethum Graveolens) J.O. Journal of Enzyme İnhibition and Medicinal Chemistry, 23 (3), 380-385.
19. Telefoncu, A. Ed., 1997. Enzimoloji, Ege Üniversitesi Fen Fakültesi, İzmir
20. Uruç, H., 2007. Katalaz Enziminin (E.C.1.11.1.6) Montmorilonit Analsim Kili Üzerine İmmobilizasyonu ve Kinetiğinin İncelenmesi. Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Van
21. Vaughn, K. C., Lax, A. R. and Duke, S. O., 1988. Polyphenol oxidase:the chloroplast oxidase with no established function. Physiol Plant, 72, 659-665.
22. Whitaker. J. R., 1972. Principles of Enzymolgy for the Food Sciences, Marcel Dekker. New York, Chapters, 22-24.
23. Yağar, H. Sağiroğlu, A., 2002. Non-Covalent İmmobilization Of Quince (Cydonia oblonga) Polyphenol Oxidase on Alumina. Acta Chim. Slov. , 49, 893−902
24. Yang C.P., Fujita S, Ashrafuzzaman M.D., Nakamura N, Hayashi N, 2008. Purification and characterization of polyphenol oxidase from banana (Musa sapientum L.) pulp. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 48, 2732–2735.
25. Zheng GQ, Kenney PM, Lam LK . 1992, Anethofuran, carvone, and limonene: potential cancer chemopreventive agents from dill weed oil and caraway oilm Planta Medica 58(4):338-41