Investigations on DNA isolation and PCR optimization in Zygaenidae (Lepidoptera) family

Öz

In recent years, molecular studies have gained increasing importance in the identification of species in Lepidoptera as well as in many insect groups and have become complementary to the comparative morphological classification. There are 54 species of the Zygaenidae family, which is spread all over the world and divided into five subfamilies, in our country In this study, optimization studies were carried out in DNA isolation and PCR analyzes using 13 Zygaenidae species collected from 31 locations in the Eastern Mediterranean Region. for DNA isolation, Qiagen DNeasy DNA isolation kit (QDNA) and Macherey Nagel Nucleospin DNA insect kit were used. It has been determined that the MN kit gives more effective and successful results than those of QDNA isolation kit in the studies on the Zygaenidae family. In addition, it was observed that the nanodrop measurement results were not instructive in the study. It is thought that it would be beneficial to try different DNA measurement techniques in future studies In PCR analysis, two different mixtures, DreamTaq PCR mixture and a modified PCR mixture according to primer and laboratory conditions, were tested. It has been seen that the commercial mixture gives much faster and more effective results, but if needed in line with the feasibilities, successful results will be obtained with the mixture created in the laboratory. In the study, the LCO1490/HCO2198 primer pair was used and it was found to be suitable for the identification of Zygaenidae species, and a success rate of 92.7% was obtained in the analysis.

Anahtar Kelimeler

• Lepidoptera
• zygaenidae
• DNA isolation
• PCR
• optimization
• COI

Zygaenidae (Lepidoptera) familyasında DNA izolasyonu ve PCR optimizasyonu üzerine araştırmalar

Öz

Son yıllarda pek çok böcek grubuyla birlikte Lepidoptera takımında da türlerin teşhis edilmesinde moleküler çalışmalar artarak önem kazanmış ve karşılaştırmalı morfolojik sınıflandırmanın tamamlayıcısı olmuştur. Tüm dünyaya yayılmış ve kendi içinde beş alt familyaya bölünmüş Zygaenidae familyasının ülkemizde 54 türü bulunmaktadır. Bu çalışmada Doğu Akdeniz Bölgesi’ndeki 31 lokasyondan toplanan 13 Zygaenidae türü kullanılarak DNA izolasyonu ve PCR analizlerinde optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. DNA izolasyonu aşamasında “Qiagen DNeasy DNA izolasyon kiti” (QDNA) ve “Macherey Nagel Nucleospin DNA Insect kiti” (MN) kullanılmıştır. Zygaenidae familyası ile ilgili yapılacak çalışmalarda MN kitinin, QDNA kitinden daha etkili ve başarılı sonuç verdiği belirlenmiştir. Ayrıca çalışmada nanodrop ölçüm sonuçlarının yol gösterici olmadığı görülmüştür. Gelecekte yapılacak çalışmalarda ise daha farklı DNA ölçüm tekniklerinin denenmesinin faydalı olacağı düşünülmektedir. PCR analizlerinde ise iki farklı karışım, DreamTaq PCR karışımı ile primer ve laboratuvar koşullarına göre modifiye edilmiş PCR karışımı, denenmiştir. Ticari karışımın çok daha hızlı ve etkin sonuç verdiği ancak olanaklar doğrultusunda ihtiyaç duyulması halinde ise laboratuvarda oluşturulan karışımla da başarılı sonuçlar elde edilebileceği görülmüştür. Çalışmada kullanılan LCO1490/HCO2198 primer çiftinin Zygaenidae türlerinin tanılanması için uygun olduğu saptanmış ve analizlerde tür tanılamasında %92.7 oranında başarı elde edilmiştir

Anahtar Kelimeler

• Lepidoptera
• zygaenidae
• DNA izolasyonu
• PCR
• optimizasyon
• COI

Kaynakça

1. Ammazzalorso AD, Zolnik CP, Daniels TJ, Kolokotronis SO, 2015. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ 3:e1147.
2. Asghar U, Malik FM, Anwar F, Javed A, Raza A, 2015. DNA Extraction From Insects By Using Different Techniques: A Review. Advances in Entomology, 3: 132-138.
3. Can F, 2009. DNA Barcoding Confirms Species Rank for a Cryptic Geometrid Species from Turkey and Bulgaria (Lepidoptera: Geometridae: Sterrhinae). Zootaxa, 2314: 63-68.
4. Chen M, Zhu Y, Tao J, Luo Y, 2008. Methodological comparison of DNA extraction from Holcocerrus hippophaecolus (Lepidoptera: Cossidae) for AFLP analysis. For. Stud. China, 10(3): 189–192.Cheung WY, Hubert N, Landry BS, 2018. A simple and rapid DNA microextraction method for plant, animal, and insect suitable for RAPD and other PCR analyses. Genome Res. 1993(3): 69-70.
5. Doğanlar F, 2003. Doğu Akdeniz Bölgesi’nde Geometidae (Lepidoptera) Familyası Üzerinde Faunastik ve Sistematik Araştırmalar. Çukurova Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi (Basılmış).
6. Doyle, JJ, Doyle, JL, 1991. Isolation of Plant DNA Fresh Tissue. Focus 12:13-15.
7. Efetov KA, Parshkova EV, Baevsky MY, Poddubov AI, 2014. Sec-butyl ester Of Dodecenoate: Synthesis and Attractive Properties. The Ukrainian Biochemical Journal, 5. 86 (6): 175–182.
8. Efetov KA, Kirsanova AV, Lazareva ZS, Parshkova EV, Tarmann GM, Rougerie R, Hebert PDN, 2019. DNA Barcoding of Zygaenidae (Lepidoptera): Results and Perspectives. Nota Lepidopterologica, 42(2):137-150.

9. Ergül, 2000. Asmalarda (Vitis vinifera L. cvs.) genomic DNA Parmak İzi Analizi ile Moleküler Karakterizasyon. Doktora Tezi, Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara.
10. Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R, Vrijenhoek R, 1994. DNA Primers for Amplification of Mitochondrial Cytochrome Coxidase Subunit I from Diverse Metazoan İnvertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 3(5): 294-299.
11. Garrevoet T, Bartsch D, Lingenhöle A, 2013. On the Knowledge of Bembecia rushana Gorbunov, 1992 and Some Related Species (Lepidoptera: Sesiidae). Nota Lepidopterologica, 36(2):95-108.
12. Hausmann A, 2001. The Geometrid Moths of Europe. Apollo Books, Volume I, 282, pp, Strenstrup-Denmark.
13. Hebert PDN, Ratnasingham S, DeWaard J, 2003. Barcoding Animal Life:Cytochrome Oxidase Subunit 1 Divergences Among Closely Related Species. Procerding of the Royal Society Biology, 270: 96-99.
14. Hofmann A, Tremewan G, 2017. Book Review: The Naturel History of Burnet Moths, Part I. 630, pp, Museum Witt Munich and Nature Research Center Vilnius.
15. Innis M, Gelfand D, 1999. Optimization of PCR: Conversations between Michael and David. Protocols for Functional Genomics: PCR Appliations, Protocols for Functional Genomics, Academic Press, 3-22 pp.
16. Kranzfelder P, Ekrem T, Stur E, 2015.Trace DNA from Insect Skins: A Comparison of Five Extraction Protocols and Direct PCR on Chironomid Pupal Exuviae. Molecular Ecology, 16(1): 353-363.
17. Kyle M, Watts T, Schade J, Elser JJ, 2003. A microfluorometric method for quantifying RNA and DNA in terrestrial insects. J Insect Sci.:3:1.
18. Marín DV, Castillo DK, López-Lavalle LAB, Chalarca JR, Pérezc CR, (2021). An Optimized High-Quality DNA Isolation Protocol for Spodoptera frugiperda J.E. Smith (Lepidoptera: Noctuidae). MethodsX, 8:101255.
19. Mironov V, 2003. The Geometrid Moths of Europe, Volume 4. Apollo Books, 464 pp, Strenstrup-Denmark.
20. Niehuis O, Naumannn CM, Misof B, 2006. Higher Phylogeny of Zygaenid Moths (Insecta: Lepidoptera) İnferred From Nuclear and Mitochondrial Sequence Data and the Evolution of Larval Cuticular Cavities. Molecular Phylogenetics and Evolution, 39(3):812-829.
21. Palma J, Valmorbida I, Guesdes JVC, 2016. Comparative Analysis of Protocols for DNA Extraction From Soybean Caterpillars. Genetics and Molecular Research, 15(2).
22. Samiea L, Champoda C, Glutzb V, Garciab M, Castellac V, Taroni F,2019. The efficiency of DNA extraction kit and the efficiency of recovery techniques to release DNA using flow cytometry. Science and Justice, 59(4): 405-410.
23. Sihvonen P, Nupponen K, 2005. Taxonomy of Rhodostrophia jacularia (Hubner, 1813)-a Sterrhinae Moth with Variable Female Wing Shape (Lepidoptera: Geometridae). Nota Lepidopterologica, 28(2):113-122.
24. Spalding A, Fukova I, Contant-Ffrench HR, 2013. The Genetics of Luperina nickerlii Freyer, 1985 in Europe s (Noctuidae). Nota Lepidopterologica, 36(1):35-46.
25. Şimşek Ö, Karaat EF, Serçe S, Aka Kaçar Y, 2005. Bazı Meyve Türlerinde Dna İzolasyon Yöntemlerinin Etkinliğinin Karşılaştırılması. Batı Akdeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü Derim Dergisi, 2008, 25(1):59-69.
26. Tarmann GM, 2005. Revision of the Australian Zygaenidae (Procridinae: Artonini). CSIRO Publishing, 320, pp, Collingwood, Australia.
27. Ulaşlı B, 2020. Doğu Akdeniz Bölgesi Zygaenidae (Lepıdoptera) Türlerinin Morfolojik ve Moleküler Yöntemlerle Tanılanması, Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi (Basılmış).
28. Ulaşlı B, Can F, 2021. Determination of Zygaenidae (Lepidoptera) Species by Morphological and Molecular Methods in The Eastern Mediterranean Region of Turkey. Turkish Journal of Entomology. 45(2): 255-268.
29. Yen SH, 2003. Phylogeny and Systematics of the Major Lineages of Chalcosiinae Sensu Lato (Zygaenidae). Crimean State Medical University Press, Simferopol, Proceedings of the 7th International Symposium on Zygaenidae, Innsbruck, September: 4–8, 2003, 293–359.
30. Yen SH, 2004. Phylogenetic Reconstruction of the Chalcosiinae (Lepidoptera, Zygaenidae s.l.). Imperial College, London. PhD Thesis (Printed).