EVALUATION OF SELECTED MICRORNA EXPRESSION PROFILES IN BORTEZOMIBRESISTANT MULTIPLE MYELOMA CELLS

Öz

Amaç: Bortezomib, multipl miyelom tedavisinde yaygın olarak kullanılan önemli bir proteazom inhibitörüdür; ancak kazanılmış direnç, ilacın uzun dönem klinik etkinliğini sınırlandırmaktadır. MikroRNA’lar apoptoz, stres yanıtı, hücresel adaptasyon ve ilaç direnci süreçlerinde rol oynayan önemli post-transkripsiyonel düzenleyicilerdir. Bu çalışmada, multipl miyelom hücre modellerinde bortezomib direnci ile ilişkili olabilecek seçilmiş mikroRNA’ların ekspresyon profillerinin araştırılması amaçlandı. Yöntem: Bortezomib dirençli U266 ve RPMI-8226 multipl miyelom hücreleri, artan konsantrasyonlarda bortezomibe sürekli maruz bırakılarak oluşturuldu. Dirençli ve kontrol hücrelerinde miR-25, miR-30c, miR-34a, miR-34c, miR-200b, miR-200c, miR-326, miR-429, miR-449a, miR-449b, miR-499a, miR-582 ve miR-708 ekspresyon düzeyleri kantitatif gerçek zamanlı PCR yöntemi ile analiz edildi. Endojen kontrol olarak U6 snRNA kullanıldı ve relatif ekspresyon düzeyleri 2⁻ΔΔCt yöntemi ile hesaplandı. Bulgular: Bortezomib dirençli U266 ve RPMI-8226 hücrelerinde hem ortak hem de hücre hattına özgü mikroRNA ekspresyon değişiklikleri gözlendi. miR-34a, miR-34c, miR-326, miR-429, miR-449a ve miR-449b her iki dirençli hücre hattında da anlamlı olarak yüksek eksprese edildi. miR-25, miR-200c ve miR-708 ekspresyonları yalnızca dirençli RPMI-8226 hücrelerinde arttı. Buna karşılık, miR-200b, miR-499a ve miR-582 iki dirençli model arasında zıt ekspresyon paternleri sergilerken, miR-30c ekspresyonunda değişiklik saptanmadı. Sonuç: Multipl miyelomda kazanılmış bortezomib direnci, hem ortak hem de hücre hattına özgü mikroRNA değişiklikleri ile ilişkilidir. miR-34, miR-326 ve miR-449 aile üyelerinin her iki dirençli hücre hattında tutarlı şekilde artmış olması, bu mikroRNA’ların proteazom inhibisyonuna karşı gelişen adaptif yanıtlarda rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Diğer mikroRNA’larda gözlenen farklı ekspresyon paternleri ise direnç mekanizmalarının heterojen yapısına işaret etmektedir. Bu mikroRNA’ların bortezomib direncindeki fonksiyonel rollerinin aydınlatılması için ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Anahtar Kelimeler

• multiple myeloma
• bortezomib resistance
• microRNA
• RT-qPCR
• proteasome inhibitor

Destekleyen Kurum

Istanbul University

Proje Numarası

DPT-2019 K12–149,071

SEÇİLMİŞ MİKRORNA EKSPRESYON PROFİLLERİNİN BORTEZOMİBE DİRENÇLİ MULTİPL MİYELOM HÜCRELERİNDE DEĞERLENDİRİLMESİ

Öz

Amaç: Bortezomib, multipl miyelom tedavisinde yaygın olarak kullanılan önemli bir proteazom inhibitörüdür; ancak kazanılmış direnç, ilacın uzun dönem klinik etkinliğini sınırlandırmaktadır. MikroRNA’lar apoptoz, stres yanıtı, hücresel adaptasyon ve ilaç direnci süreçlerinde rol oynayan önemli post-transkripsiyonel düzenleyicilerdir. Bu çalışmada, multipl miyelom hücre modellerinde bortezomib direnci ile ilişkili olabilecek seçilmiş mikroRNA’ların ekspresyon profillerinin araştırılması amaçlandı. Yöntem: Bortezomib dirençli U266 ve RPMI-8226 multipl miyelom hücreleri, artan konsantrasyonlarda bortezomibe sürekli maruz bırakılarak oluşturuldu. Dirençli ve kontrol hücrelerinde miR-25, miR-30c, miR-34a, miR-34c, miR-200b, miR-200c, miR-326, miR-429, miR-449a, miR-449b, miR-499a, miR-582 ve miR-708 ekspresyon düzeyleri kantitatif gerçek zamanlı PCR yöntemi ile analiz edildi. Endojen kontrol olarak U6 snRNA kullanıldı ve relatif ekspresyon düzeyleri 2⁻ΔΔCt yöntemi ile hesaplandı. Bulgular: Bortezomib dirençli U266 ve RPMI-8226 hücrelerinde hem ortak hem de hücre hattına özgü mikroRNA ekspresyon değişiklikleri gözlendi. miR-34a, miR-34c, miR-326, miR-429, miR-449a ve miR-449b her iki dirençli hücre hattında da anlamlı olarak yüksek eksprese edildi. miR-25, miR-200c ve miR-708 ekspresyonları yalnızca dirençli RPMI-8226 hücrelerinde arttı. Buna karşılık, miR-200b, miR-499a ve miR-582 iki dirençli model arasında zıt ekspresyon paternleri sergilerken, miR-30c ekspresyonunda değişiklik saptanmadı. Sonuç: Multipl miyelomda kazanılmış bortezomib direnci, hem ortak hem de hücre hattına özgü mikroRNA değişiklikleri ile ilişkilidir. miR-34, miR-326 ve miR-449 aile üyelerinin her iki dirençli hücre hattında tutarlı şekilde artmış olması, bu mikroRNA’ların proteazom inhibisyonuna karşı gelişen adaptif yanıtlarda rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Diğer mikroRNA’larda gözlenen farklı ekspresyon paternleri ise direnç mekanizmalarının heterojen yapısına işaret etmektedir. Bu mikroRNA’ların bortezomib direncindeki fonksiyonel rollerinin aydınlatılması için ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Anahtar Kelimeler

• multipl miyelom
• bortezomib direnci
• mikroRNA
• RT-qPCR
• Proteozom inhibitörü

Destekleyen Kurum

Istanbul Universitesi

Proje Numarası

DPT-2019 K12–149,071

Kaynakça

1. Rajkumar SV. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. Am J Hematol. 2020;95(5):548-567. doi:10.1002/ajh.25791
2. Kumar SK, Rajkumar V, Kyle RA, et al. Multiple myeloma. Nat Rev Dis Primers. 2017;3:17046. doi:10.1038/nrdp.2017.46
3. Adams J. The proteasome: structure, function, and role in the cell. Cancer Treat Rev. 2003;29 Suppl 1:3-9. doi:10.1016/s0305-7372(03)00081-1
4. Manasanch EE, Orlowski RZ. Proteasome inhibitors in cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2017;14(7):417-433. doi:10.1038/nrclinonc.2016.206
5. Mitsiades N, Mitsiades CS, Poulaki V, et al. Molecular sequelae of proteasome inhibition in human multiple myeloma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(22):14374-14379. doi:10.1073/pnas.202445099
6. Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004;116(2):281-297. doi:10.1016/s0092-8674(04)00045-5
7. Di Leva G, Garofalo M, Croce CM. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2014;9:287-314. doi:10.1146/annurev-pathol-012513-104715
8. Pichiorri F, Suh SS, Ladetto M, et al. MicroRNAs regulate critical genes associated with multiple myeloma pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(35):12885-12890. doi:10.1073/pnas.0806202105

9. Zhou Y, Chen L, Barlogie B, et al. High-risk myeloma is associated with global elevation of miRNAs and overexpression of EIF2C2/AGO2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(17):7904-7909. doi:10.1073/pnas.0908441107
10. He L, He X, Lim LP, et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 2007;447(7148):1130-1134. doi:10.1038/nature05939
11. Hermeking H. The miR-34 family in cancer and apoptosis. Cell Death Differ. 2010;17(2):193-199. doi:10.1038/cdd.2009.56
12. Gregory PA, Bert AG, Paterson EL, et al. The miR-200 family and miR-205 regulate epithelial to mesenchymal transition by targeting ZEB1 and SIP1. Nat Cell Biol. 2008;10(5):593-601. doi:10.1038/ncb1722
13. Brabletz S, Brabletz T. The ZEB/miR-200 feedback loop--a motor of cellular plasticity in development and cancer. EMBO Rep. 2010;11(9):670-677. doi:10.1038/embor.2010.117
14. Liang Z, Wu H, Xia J, et al. Involvement of miR-326 in chemotherapy resistance of breast cancer through modulating expression of multidrug resistance-associated protein 1. Biochem Pharmacol. 2010;79(6):817-824. doi:10.1016/j.bcp.2009.10.017
15. Bockhorn J, Dalton R, Nwachukwu C, et al. MicroRNA-30c inhibits human breast tumour chemotherapy resistance by regulating TWF1 and IL-11. Nat Commun. 2013;4:1393. doi:10.1038/ncomms2393
16. Garofalo M, Croce CM. microRNAs: Master regulators as potential therapeutics in cancer. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2011;51:25-43. doi:10.1146/annurev-pharmtox-010510-100517
17. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987;162(1):156-159. doi:10.1006/abio.1987.9999
18. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 2001;25(4):402-408. doi:10.1006/meth.2001.1262
19. Di Martino MT, Leone E, Amodio N, et al. Synthetic miR-34a mimics as a novel therapeutic agent for multiple myeloma: in vitro and in vivo evidence. Clin Cancer Res. 2012;18(22):6260-6270. doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-1708
20. Obeng EA, Carlson LM, Gutman DM, Harrington WJ Jr, Lee KP, Boise LH. Proteasome inhibitors induce a terminal unfolded protein response in multiple myeloma cells. Blood. 2006;107(12):4907-4916. doi:10.1182/blood-2005-08-3531
21. Meister S, Schubert U, Neubert K, et al. Extensive immunoglobulin production sensitizes myeloma cells for proteasome inhibition. Cancer Res. 2007;67(4):1783-1792. doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-2258
22. Ling SC, Lau EK, Al-Shabeeb A, et al. Response of myeloma to the proteasome inhibitor bortezomib is correlated with the unfolded protein response regulator XBP-1. Haematologica. 2012;97(1):64-72. doi:10.3324/haematol.2011.043331
23. Noonan EJ, Place RF, Basak S, Pookot D, Li LC. miR-449a causes Rb-dependent cell cycle arrest and senescence in prostate cancer cells. Oncotarget. 2010;1(5):349-358. doi:10.18632/oncotarget.167
24. Lizé M, Pilarski S, Dobbelstein M. E2F1-inducible microRNA 449a/b suppresses cell proliferation and promotes apoptosis. Cell Death Differ. 2010;17(3):452-458. doi:10.1038/cdd.2009.188
25. Zhu B, V M, Finch-Edmondson M, et al. miR-582-5p Is a Tumor Suppressor microRNA Targeting the Hippo-YAP/TAZ Signaling Pathway in Non-Small Cell Lung Cancer. Cancers (Basel). 2021;13(4):756. doi:10.3390/cancers13040756
26. Behrman S, Acosta-Alvear D, Walter P. A CHOP-regulated microRNA controls rhodopsin expression. J Cell Biol. 2011;192(6):919-927. doi:10.1083/jcb.201010055
27. Monteleone NJ, Lutz CS. miR-708-5p: a microRNA with emerging roles in cancer. Oncotarget. 2017;8(41):71292-71316. doi:10.18632/oncotarget.19772