Snap Frozen ve Doğrudan -80°C’de Dondurulan Karaciğer Dokularında RNA Kalitesi

Yıl 2018, Cilt: 58 Sayı: 1, 42 - 47, 12.06.2018

Hüseyin Özkan Akin Yakan

Öz

 Gen ekspresyonu çalışmalarıyla hücre ve dokulardan RNA izole edilerek hücrelerin fizyolojik ve biyolojik değişikliklere verdikleri cevap mRNA düzeyinde incelenebilmektedir. Oldukça hassas bir molekül olan RNA’nın stabilitesi dokudan dokuya değişiklik göstermektedir. Dokulardaki RNA, ilgili canlıdan alınmasından itibaren nükleazlara maruz kalarak hızlı bir şekilde yıkımlanmaktadır. Yıkımlanmanın (degradasyon) kontrol altına alınması amacıyla ilgili dokunun dondurulması ya da bazı kimyasallarla muamele edilmesi gerekmektedir. Protein tabiatındaki nükleazlar düşük sıcaklıklarda inaktif olmakta ve bu yüzden birçok çalışmada bazı kimyasallar ile doğrudan -80°C’de dondurma ya da snap frozen olarak bilinen sıvı azotla dondurma yöntemleri tercih edilmektedir. Bu araştırma, ratlarda iki farklı yöntem kullanılarak stoklanan karaciğer dokularından izole edilen RNA’ların konsantrasyon, saflık ve bütünlük kriterlerinin değerlendirilmesi amacıyla yapılmıştır. Çalışmada 6 aylık yaşta 8 rata ait karaciğer dokusu kullanılmıştır. Doğrudan -80°C ve snap frozen yöntemiyle dondurulan karaciğer dokularından izole edilen RNA konsantrasyonları sırasıyla 1039,64 ve 503,14 ng/µl, saflıkları 1,98 ile 1,97 ve referans gene (PPIA) ait Ct sonuçları 16,537 ve 17,463 olarak bulunmuştur. Sonuç olarak, gen ekspresyonu çalışmalarında kullanılacak RNA’nın kalite değerlendirmesinde konsantrasyon, agaroz jel görüntüsü, erime eğrisi ve Ct değerleri bakımından bir bütün olarak değerlendirilmesi gerektiği ve snap frozen yöntemin halen en uygun yöntemlerden biri olduğu ortaya konulmuştur. 

Anahtar Kelimeler

Snap Frozen, Doğrudan -80°C, RNA kalitesi, Gen ekspresyonu

Kaynakça

• 1. Bao W, Zhang X, Zhang J, Zhou W, Bi T, Wang J, Yan W, Lin A (2012): Biobanking of fresh-frozen human colon tissue: Impact of tissue ex-vivo ischemia times and storage periods on RNA quality. Ann Surg Oncol. DOI 10.1245/s10434-012-2440-1. 2. Botling J, Edlund K, Segersten U, Tahmasebpoor S, Engström M, Sundström M, Malmström P, Micke P (2009): Impact of thawing on RNA integrity and gene expression analysis in fresh frozen tissue. Diagn Mol Pathol, 18: 44- 52. 3. Faix PH (2008): Preventing RNA degradation is difficult, but newer systems for protecting this molecule may lead the way to better gene expression analysis. Drug Discovery and Development, 4: 44- 47. 4. Fleige S, Pfaffl MW (2006): RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine, 27: 126- 139. 5. Gonzales-Herrera L, Valenzuela A, Marchal JA, Lorente JA, Villanueva E (2013): Studies on RNA integrity and gene expression in human myocardial tissue, pericardial fluid and blood, and its postmortem stability. Forensic Science International, 232: 218- 228. 6. Houseley J, Tollervey D (2009): The many pathways of RNA degradation. Cell, 136: 763- 776. 7. LaCava J, Houseley J, Saveanu C, Petfalski E, Thompson E, Jacquiler A, Tollervey D (2005): RNA degradation by the exosome is promoted by a nuclear polyadenylation complex. Cell, 121: 713- 724. 8. Li J, Smyth P, Flavin R, Cahill S, Denning K, Aherne S, Guenther SM, O’Leary JJ, Sheils O (2007): Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin- fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnology, 7(36): 1- 6. 9. Ma H, Shich K, Chen G, Qiao T, Chuang M (2006): Application of Real-Time Polymerase Chian Reaction (RT-PCR). The Journal of American Science, 2(3): 1- 15. 10. Ma J, Pan H, Zeng Y, Lv Y, Zhang H, Xue A, Jiang J, Ma K, Chen L (2015): Exploration of the R code-based mathemetical model for PMI estimation using profikling of RNA degradation in rat brain tissue at different temperatures. Forensic Sci Med Pathol, 11: 530- 537. 11. Perlmutter MA, Best CJM, Gillespie JW, Gathright Y, Gonzales S, Velasco A, Linehan WM, Emmert-Buck MR, Chuaqui RF (2004): Comparison of snap freezing versus ethanol fixation for gene expression profiling of tissue specimens. Journal of Molecular Diagnostics, 6(4): 371- 377. 12. Sampaio-Silva F, Magalhaes T, Carvalho F, Dinis-Oliveira RJ (2013): Profiling of RNA degradation for estimation of Post Morterm interval. PLOS One, 8(2): 1- 8. 13. Santos BP, Costa Diesel LF, Silva Meirelles L, Nardi NB, Camassola M (2016): Identification of suitable reference genes for quantitative gene expression analysis in rat adipose stromal cells induced to trilineage differentiation. Gene, 594(2): 211-219. 14. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S (2002): Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology, 161: 1961- 1971. 15. Vermeulen J, Preter K, Lefever S, Nuytens J, Vloed F, Derveaux S, Hellemans J, Speleman F, Vandesompele J (2011): Measurable impact of RNA quality on gene expression results from quantitative PCR. Nucleic Acids Research, 39:1- 12. 16. Watson JD (2004): Molecular biology of the gene. p: 97- 128. In: The structures of DNA and RNA, 5th Edition, CSHL Press, USA. 17. Wen-Can L, Kai-Jun M, Ping Z, Hui P, Heng Z, Hui-Jun W, Duan M, Long C (2014): Postmortem interval determination using 18S-rRNA and microRNA. Science and Justice, 54: 307- 310. 18. Zhao D, Zhu B, Ishikawa T, Quan L, li D, Maeda H (2006): Realtime RT-PCR quantitative assays and postmortem degradation profiles of erythropoietin, vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor 1 alpha mRNA transcripts in forensic autopsy materials. Legal Medicine, 8: 132- 136. 19. Zhang H, Zhang P, Ma K, Lv Y, Li W, Luo C, Li L, Shen Y, He M, Jiangle Q, Chen L (2013): The selection of endogenous genes in human postmortem tissues. Science and Justice, 53: 115- 120.